舒尔经胶囊对药物流产后大鼠子宫组织ER、PR、PRLR表达及内膜病理形态的影响

项涛 陈彪 马文擎 翁艳洁

人工流产是暂无生育要求但意外怀孕女性的唯一补救措施，近年来，其发生率一直呈增加趋势[1]。临床上人工终止妊娠方法有手术流产和药物流产两种，其中，药物流产较手术流产使用方便、痛苦小，被广大妇女接受[2]。然而，尽管临床医学技术在不断进步，药物流产的安全性与有效性也更有保障，但其弊端及不足仍存在。研究表明，药物流产可能出现出血量大、出血时间长等副作用，进而可引发子宫内膜炎、盆腔炎等多种疾病，严重可导致不孕[3-4]。雌激素、孕激素、催乳素等是维持女性正常内分泌的重要激素，分别通过与靶细胞上的雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)、催乳素受体(prolactin receptor，PRLR)结合发挥作用，其分泌紊乱会引发子宫内膜的一系列病理变化[5-7]。舒尔经胶囊具有疏肝活血、调经止痛的功效，常用于痛经、月经量少、后错属气滞血瘀证者，近年来发现，其在流产术后子宫内膜修复上具有一定疗效[8]。本研究将通过研究舒尔经胶囊对药物流产后大鼠子宫组织ER、PR、PRLR表达及内膜病理形态的影响，以期为减少药物流产副作用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性SD大鼠50只，雄性大鼠25只，健康性成熟且未生育，体质量(200±5)g，许可证号：SYXK(鲁)2017-0030，购于山东新创生物科技有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

舒尔经胶囊(国药准字Z20025985)购自海南博大制药厂；宫血宁(国药准字Z20020087)购自云南白药集团股份有限公司；实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)试剂盒(货号：K1002S)购自美国Promega公司；ER、PR、PRLR、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) mRNA引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；雌激素酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(货号：K3829-100)购自美国Biovision公司；孕激素ELISA试剂盒(货号：CSB-E07282r)购自美国Cusabio公司；催乳素ELISA试剂盒、ER抗体、PR抗体、PRLR抗体、GAPDH抗体(货号：ab100736、ab3575、ab63605、ab214303、ab181602)购自abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(货号：0295G-HRP)购自美国santa公司；光学显微镜(型号：SZ51/SZ61)购自日本Olympus/奥林巴斯；荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500)为美国Applied Biosystems公司产品；化学发光成像系统(型号：ChemiDocXRS)购自美国Bio-Rad公司。

1.3 药物流产大鼠模型制备、分组与给药

将大鼠于下午5:00按雌雄2∶1合笼交配，次日上午8：00行雌鼠阴道涂片检查，以检出精子的当天为妊娠第1天。未检出精子的雌鼠于下午5:00继续合笼交配，连续3天，共获得妊娠大鼠40只。

将40只妊娠大鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、舒尔经胶囊低剂量组和舒尔经胶囊高剂量组，每组8只。模型组、阳性对照组、舒尔经胶囊低剂量组和舒尔经胶囊高剂量组妊娠大鼠于妊娠第7天上午8：00给予米非司酮16.6 mg/kg灌胃1次，于下午18：00给予米索前列醇100 μg/kg灌胃1次，制作大鼠药物流产模型。

造模成功后次日，空白对照组、模型组给予生理盐水，阳性对照组给予宫血宁10 mg/kg，舒尔经胶囊低、高剂量组分别给予舒尔经胶囊190 mg/kg、330 mg/kg，每天给药1次，给药体积均为1.0 mL/100 g体重，连续7天。

1.4 标本采集

各组大鼠给药结束后24小时内，给予7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，将大鼠处死，分离大鼠子宫。

1.5 苏木素-伊红(hematoxylin-Eosin，HE)染色观察子宫内膜组织病理学变化

子宫组织经10%福尔马林溶液固定、常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜观察子宫内膜组织病理学变化。子宫所有形态改变根据以下评分标准进行评分：①0分：胚囊完整，绒毛与蜕膜残留多；②1分：胚囊排出，无绒毛残留，较多蜕膜组织残留；③2分：胚囊排出，无绒毛残留，少量蜕膜组织残留或子宫内膜修复不好；④3分：胚囊排出，无绒毛残留，无蜕膜组织残留，子宫内膜未较好修复；⑤4分：胚囊排出，无绒毛残留，无蜕膜组织残留，子宫内膜较好修复。

1.6 ELISA法检测血清雌激素、孕激素、催乳素水平

将腹主动脉血4℃ 3000 r/min，离心10分钟，取上层血清。ELISA法检测血清雌激素、孕激素、催乳素水平，试验方法均按照试剂盒说明书进行，酶标仪测定波长450 nm处吸光度值，计算血清雌激素、孕激素、催乳素水平。

1.7 qRT-PCR法检测子宫组织中ER、PR、PRLR mRNA表达水平

使用TRIzol试剂提取各组子宫组织中总RNA，逆转录合成cDNA，采用qRT-PCR法检测ER、PR、PRLR mRNA表达水平，内参基因为GAPDH。反应程序：95℃预变性10分钟；95℃变性10秒，55℃退火35秒，72℃延伸1分钟，循环40次；72℃延伸10分钟。ER上游引物：5′-CCACCAACCAGTGCACCATT-3′，下游引物：5′-GGTCTTTTCGTATCCCACCTTTC-3′；PR上游引物：5′-TCGTACAAGCATGTCAGTGGACAC-3′，下游引物：5′-CATGGTAAGGCACAGCGAGTACAA-3′；PRLR上游引物：5′-CCAGATGGAAGTGTACTGCTTGGTA-3′，下游引物：5′-GGTGGAATCCTGGGACAGATC-3′；内参GAPDH上游引物：5′-CCACTTGAAGGGTGGAGC-3′，下游引物：5′-TGAAGTCGCAGGAGACAA-3′。Ct值为扩增产物的荧光信号达到临界阈值时对应的循环数，相对表达量以2-ΔΔCt法表示。

1.8 蛋白印迹(western blot，WB)法检测子宫组织中ER、PR、PRLR蛋白表达水平

使用蛋白提取试剂盒提取各组子宫组织中总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度并进行定量。电泳分离等量蛋白质并转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1小时，分别加入ER抗体、PR抗体、PRLR抗体、GAPDH抗体(1∶500)，4℃孵育过夜，TBST洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶5000)，室温孵育1小时，免疫反应化学发光法显色，Tanon 600图像分析系统拍摄图像并分析条带灰度，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 舒尔经胶囊对药物流产后大鼠子宫内膜病理形态的影响

空白对照组子宫内膜结构完整，上皮细胞排列紧密，血管和腺体清晰可见。模型组子宫内膜严重受损，腺体和血管稀少，子宫内膜变薄明显。与模型组相比，阳性对照组、舒尔经胶囊低剂量组、舒尔经胶囊高剂量组子宫内膜的厚度及子宫内膜腺体、血管数量明显增加，大鼠子宫组织病理学评分显著升高(P<0.05)；与舒尔经胶囊低剂量组相比，阳性对照组、舒尔经胶囊高剂量组，大鼠子宫组织病理学评分显著升高(P<0.05)；阳性对照组与舒尔经胶囊高剂量组大鼠子宫组织病理学评分差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。

注： A：空白对照组；B：模型组；C:阳性对照组；D:舒尔经胶囊低剂量组；E:舒尔经胶囊高剂量组。

表1 各组大鼠子宫组织病理学评分比较

2.2 舒尔经胶囊对药物流产后大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平的影响

与空白对照组相比，模型组、阳性对照组、舒尔经胶囊低剂量组、舒尔经胶囊高剂量组大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平均显著降低(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组、舒尔经胶囊低剂量组、舒尔经胶囊高剂量组大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平显著升高(P<0.05)；与舒尔经胶囊低剂量组相比，阳性对照组、舒尔经胶囊高剂量组大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平显著升高(P<0.05)；阳性对照组与舒尔经胶囊高剂量组大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 舒尔经胶囊对药物流产后大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR mRNA表达水平的影响

与空白对照组相比，模型组、阳性对照组、舒尔经胶囊低剂量组、舒尔经胶囊高剂量组大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组、舒尔经胶囊低剂量组、舒尔经胶囊高剂量组大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；与舒尔经胶囊低剂量组相比，阳性对照组、舒尔经胶囊高剂量组大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；阳性对照组与舒尔经胶囊高剂量组大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4 舒尔经胶囊对药物流产后大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR蛋白表达水平的影响

与空白对照组相比，模型组、阳性对照组、舒尔经胶囊低剂量组、舒尔经胶囊高剂量组大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组、舒尔经胶囊低剂量组、舒尔经胶囊高剂量组大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与舒尔经胶囊低剂量组相比，阳性对照组、舒尔经胶囊高剂量组大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；阳性对照组与舒尔经胶囊高剂量组大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表4。

表2 各组大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平比较

表3 各组大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR mRNA表达水平比较

表4 各组大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR蛋白表达水平比较

图2 各组大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR蛋白表达情况

3 讨论

数据显示，中国每年人工流产约有1300万人次，药物流产约有1000万人次，位居世界第一，尽管各种避孕方法正在不断推广，但人工流产的发生率仍在不断增加[9]。手术流产为机械性操作，对机体损伤大，易导致盆腔炎、月经紊乱等并发症，恢复时间长，大多数女性难以完全接受，而药物流产通常具有安全、有效、简便等特点，更易被人接受[10]。然而，药物流产后流产不全、绒毛蜕膜残留、子宫收缩乏力及继发宫内感染会导致月经紊乱、贫血、异常子宫出血、盆腔炎、不孕等危害，是药物流产亟需进一步解决的问题[11]。

舒尔经胶囊成分为当归、牡丹皮、赤芍、柴胡、桃仁、陈皮、香附、牛膝、益母草、延胡索、白芍，主要用来治疗痛经及月经量少等症状[12]。近年来发现，舒尔经胶囊在治疗人工流产并发症上具有较好的疗效。杜就旧等[13]研究表明，舒尔经颗粒联合戊酸雌二醇预防人工流产术后宫腔粘连的疗效优于单用戊酸雌二醇。孙川等[8]研究表明，人流术后采用舒尔经颗粒联合补佳乐进行治疗，可以缩短流产后出血时间及转经时间，改善临床症状及体内性激素水平，增加子宫内膜厚度。本研究结果显示，与模型组相比，舒尔经胶囊低剂量组、舒尔经胶囊高剂量组大鼠子宫组织病理学评分显著升高，子宫内膜厚度及子宫内膜腺体、血管数量显著增加，其中胶囊高剂量组大鼠相应指标与阳性对照组差异无统计学意义，说明舒尔经胶囊可促进胚囊排出，减少绒毛、蜕膜残留，增加子宫内膜厚度及子宫内膜腺体，促进血管生成，使子宫内膜得到较好地修复，效果与传统药物宫血宁相差不大。

雌激素、孕激素、催乳素是维持女性正常内分泌、反映妇科内分泌功能的重要激素，在妊娠过程中，正常的雌激素、孕激素、催乳素等激素水平与子宫内膜中激素受体结合，在子宫内膜变化中起重要作用[14-16]。Chlebowski等[17]研究表明，孕激素可减轻子宫内膜癌风险，在绝经后妇女中，孕激素联合雌激素连续使用可降低子宫内膜癌的发病率。Mei等[18]研究表明，雌激素可以通过CXCL12/CXCR4生物轴上调介导的自噬抑制促进人分泌期子宫内膜基质细胞的存活。宋秀云等[19]研究表明，对于临床上选择药物流产的患者，为了减轻流产后阴道出血量，可在治疗中加用雌激素、孕激素，不仅能提高止血效果，还可减少并发症。李福明等[20]研究表明，扶正消癌方联合他莫昔芬调节血清催乳素、孕酮、雌二醇等性激素水平，可缓解他莫昔芬所致子宫内膜增厚。本研究结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平及子宫组织中相应受体ER、PR、PRLR mRNA和蛋白表达水平均显著降低，提示大鼠药物流产后子宫内膜严重受损，体内性激素及相应受体表达均受到影响。进一步研究发现，与模型组相比，阳性对照组、舒尔经胶囊低剂量组、舒尔经胶囊高剂量组大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平及子宫组织中相应受体ER、PR、PRLR mRNA和蛋白表达水平均显著升高，提示舒尔经胶囊可提高药物流产大鼠血清中性激素及子宫内膜中相应受体水平，进而使严重受损的子宫内膜得到修复。

综上所述，舒尔经胶囊可以提高药物流产后大鼠子宫组织中ER、PR、PRLR表达水平，促进子宫内膜修复，改善子宫内膜形态，值得进一步进行临床研究。