骨桥蛋白表达与胰腺癌患者临床特征及预后的关系

刘亮，朱旭，张超，韩晓书

抚顺市中心医院消化内科，辽宁 抚顺 113006

胰腺癌是一种常见的消化道肿瘤，其恶性程度高、易浸润转移、预后较差，患者的5年生存率不足5%，近年来国内外胰腺癌的发病率均呈明显上升趋势，严重威胁患者的生命安全[1]。早期诊疗和评估病情对于延长胰腺癌患者的生存时间、改善其预后十分关键。临床研究认为，胰腺癌预后差与肿瘤的浸润性生长、早期转移等密切相关[2-3]。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种糖基化磷蛋白，参与肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等多种实体瘤的转移、浸润、侵袭等过程[4-6]。因此，推测OPN与胰腺癌的预后具有一定的关系。目前关于OPN在胰腺癌组织中的表达及与患者临床特征关系的研究却鲜有报道，且尚未有准确定论。基于上述理论基础及既往文献报道，本研究采用免疫组织化学染色法检测胰腺癌组织中OPN的表达情况，并分析其与胰腺癌患者临床特征及预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月至2016年12月抚顺市中心医院收治的胰腺癌患者的病历资料。纳入标准：①经病理诊断证实为胰腺导管腺癌，符合《胰腺癌诊治指南（2014版）》[7]中胰腺癌的诊断标准；②非急诊手术患者；③术前未接受过放化疗等抗肿瘤治疗；④病理组织接受OPN检测；⑤病历资料及随访资料完整。排除标准：①生存时间＜6个月；②合并其他部位恶性肿瘤；③合并自身免疫疾病及全身疾患；④合并血液系统疾病；⑤合并严重躯体疾病；⑥合并全身急慢性感染；⑦合并心脏病、糖尿病、冠心病等严重内科疾病；⑧合并器质性功能障碍。依据纳入和排除标准，本研究共纳入75例胰腺癌患者，收集胰腺癌组织75例及癌旁组织（距胰腺癌组织≥5 cm）30例。

1.2 免疫组织化学染色方法及结果判定

采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase，SP）法检测OPN的表达情况。术中取得胰腺癌组织或癌旁组织，石蜡包埋后，4 μm厚连续切片，常规脱蜡水化后，63℃烤箱中烘烤1 h，然后分别置于二甲苯及100%、90%、80%乙醇中浸泡，以封闭内源性过氧化物酶活性。采用枸橼酸盐进行微波抗原修复，降至室温后水洗，然后磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，每次5 min，滴加阻断剂，置于室温下15 min。滴加一抗（工作浓度为1∶600），4 ℃孵育24 h，PBS冲洗3次，每次1 min；滴加生物素标记的二抗，室温孵育30 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加SP试剂，37℃孵育1 h，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染，脱水、干燥、中性树脂封片。采用PBS代替一抗作为阴性对照。

OPN阳性主要表现为棕黄色颗粒沉着。每张切片随机选择5个高倍视野进行评估，根据染色强度及阳性细胞百分比进行半定量分析。染色强度评分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。阳性细胞百分比评分：阳性细胞百分比≤5%为0分，5%＜阳性细胞百分比≤25%为1分，25%＜阳性细胞百分比≤50%为2分，阳性细胞百分比＞50%为3分。染色强度评分与阳性细胞百分比评分相加，0～3分为阴性，≥4分为阳性[8-9]。

1.3 观察指标

比较胰腺癌组织和癌旁组织中OPN的表达情况，分析胰腺癌组织中OPN表达与患者临床特征（性别、年龄、肿瘤直径、临床分期、分化程度、淋巴结转移情况）的关系。采用门诊、电话随访或走访等形式对患者进行3年随访，每3个月随访1次，随访截止时间为2019年12月，记录所有患者的生存时间，分析胰腺癌患者预后的影响因素。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Logistic回归模型进行多因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组织和癌旁组织中OPN表达情况的比较

OPN阳性表达主要位于细胞质中。胰腺癌组织中OPN的阳性表达率为65.33%（49/75），明显高于癌旁组织的20.00%（6/30），差异有统计学意义（χ2=17.655，P=0.000）。

2.2 不同临床特征胰腺癌患者胰腺癌组织中OPN表达情况的比较

不同性别、年龄、肿瘤直径的胰腺癌患者胰腺癌组织中OPN的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移的胰腺癌患者胰腺癌组织中OPN的阳性表达率分别高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征胰腺癌患者胰腺癌组织中OPN表达情况的比较（ n=75）

2.3 生存情况

截至随访终点，所有患者均全部完成随访，75例胰腺癌患者中，15例患者生存，60例患者死亡，3年生存率为20.00%（15/75）。

2.4 胰腺癌患者预后影响因素的单因素分析

不同性别、肿瘤直径的胰腺癌患者的3年生存率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。年龄＜55岁、临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移、OPN阴性表达的胰腺癌患者的3年生存率分别高于年龄≥55岁、临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移、OPN阳性表达的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 胰腺癌患者预后影响因素的单因素分析（ n=75）

2.5 胰腺癌患者预后影响因素的多因素Logistic回归分析

以单因素分析中差异有统计学意义的因素（年龄、临床分期、分化程度、淋巴结转移及OPN表达情况）作为自变量，以胰腺癌患者预后作为因变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，临床分期、分化程度、淋巴结转移情况及OPN表达情况均是胰腺癌患者预后的独立影响因素（P＜0.05）。（表3）

表3 胰腺癌患者预后影响因素的多因素Logistic回归分析（ n=75）

3 讨论

胰腺癌是目前临床中预后最差的恶性肿瘤之一，以手术、放化疗为主的传统治疗方式疗效有限，患者的生存时间较短[10]。研究认为，胰腺癌患者的生存时间与诸多因素密切相关，而肿瘤的浸润生长及转移则是影响预后的重要原因，因此，浸润转移相关蛋白表达情况的分析是临床研究热点及改善胰腺癌预后的关键[11-12]。OPN是一种分泌型糖基化磷蛋白，广泛存在于机体体液、胃肠道、胰腺、肺等组织中，且在细胞的黏附迁移、组织修复及信号转导中发挥重要作用[13]。随着肿瘤研究的不断深入，研究发现OPN参与了多种实体瘤的侵袭、转移等过程，可作为肿瘤转移的标志物及预后指标[14-15]。关于OPN参与肿瘤侵袭、转移、转化等过程的作用机制，相关研究指出，OPN能够激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号转导通路，活化NF-κB，并使其由细胞质进入细胞核，与转移相关基因位点或κ位点结合，增强转移相关分子的活性，提高其表达水平，促进肿瘤细胞的侵袭、转移[16-17]。国外研究指出，肿瘤细胞或基质细胞产生的OPN均能够促进肿瘤细胞的浸润转移，在细胞、动物实验及临床实体瘤试验中，均能够得出OPN与肿瘤转移密切相关的结论[18]。OPN又称为早期T淋巴细胞活化因子，是一种多功能细胞外基质蛋白，不仅能够影响肿瘤迁移、侵袭中细胞的转化功能，还可影响宿主细胞的免疫功能。OPN与CD44分子结合后，可增加髓系来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）的生成，发挥免疫抑制功能，从而逃避肿瘤免疫，促进肿瘤细胞的浸润转移。

本研究比较了OPN在胰腺癌组织与癌旁组织中的表达情况，结果显示，OPN阳性表达主要位于细胞质中，胰腺癌组织中OPN的阳性表达率为65.33%，明显高于癌旁组织的20.00%，差异有统计学意义（P＜0.01），说明OPN在胰腺癌组织中高表达。国外相关研究表明，与正常胰腺组织比较，胰腺导管癌组织中OPN过表达，且胰腺癌患者血浆中OPN的浓度亦明显升高，与本研究结果基本一致[19]。本研究进一步比较了不同临床特征胰腺癌患者胰腺癌组织中OPN的表达情况，结果显示，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移的胰腺癌患者胰腺癌组织中OPN的阳性表达率分别高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明OPN阳性表达与胰腺癌患者的临床分期、分化程度及淋巴结转移情况有关，临床分期晚、肿瘤分化程度低、有淋巴结转移的胰腺癌患者胰腺癌组织中OPN的阳性表达率较高。肿瘤分化程度预示着肿瘤的恶化程度，在临床上能够提示患者的预后情况，而临床分期及淋巴结转移则通常被认为是预测患者预后的重要指标[20]。以上结果说明OPN在胰腺癌病情进展、肿瘤浸润转移中均发挥重要作用，并影响患者预后。

美国国家卫生研究院的报告指出，胰腺癌患者的1年生存率为8%，5年生存率为3%，中位生存时间为2～3个月[21]。本研究通过3年的随访发现，75例胰腺癌患者的3年生存率为20.00%，略高于上述研究报道的结果，可能与本研究纳入的样本量少、统计学分析存在偏倚有关。胰腺癌患者预后受多种因素影响，本研究采用单因素及多因素Logistic回归模型分析胰腺癌患者预后的影响因素，结果显示，年龄＜55岁、临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移、OPN阴性表达的胰腺癌患者的3年生存率分别高于年龄≥55岁、临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移、OPN阳性表达的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；临床分期、分化程度、淋巴结转移情况及OPN表达情况均是胰腺癌患者预后的独立影响因素（P＜0.05），说明临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移、OPN阳性患者的预后往往更差。OPN阳性的胰腺癌患者大多进展至晚期，且存在淋巴结转移，因此生存时间更短，预后不良，提示OPN能够作为评估胰腺癌病情及预后的重要辅助指标。

综上所述，胰腺癌组织中OPN高表达，且OPN阳性表达与胰腺癌患者的临床分期、分化程度及淋巴结转移情况有关。OPN表达情况是胰腺癌患者预后的独立影响因素，OPN阳性表达患者的预后较差，生存时间较短。