益气温阳活血利水方对戊巴比妥钠诱导的H9C2心肌细胞线粒体自噬的影响

王强，杨静，修成奎，孙伟，李琪琳，于洁，王辉奇，霍艳明

益气温阳活血利水方对戊巴比妥钠诱导的H9C2心肌细胞线粒体自噬的影响

王强1，杨静2，修成奎2，孙伟1，李琪琳1，于洁1，王辉奇1，霍艳明1

1.中国中医科学院望京医院，北京 100102；2.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700

观察益气温阳活血利水方对戊巴比妥钠诱导H9C2细胞损伤后线粒体自噬的影响。戊巴比妥钠诱导建立H9C2心肌细胞自噬模型。实验分为空白对照组、模型组、去乙酰毛花苷组和益气温阳活血利水方低、中、高剂量组，各给药组给予相应药物。运用电子显微镜观察自噬小体、线粒体超微结构，三磷酸腺苷（ATP）试剂盒检测心肌细胞ATP浓度，运用活性氧（ROS）荧光探针测定ROS含量，Western blot检测自噬蛋白Beclin 1的表达。与模型组比较，益气温阳活血利水方干预后H9C2细胞线粒体边界较清晰，肿胀缓解，空泡明显减少，ATP含量明显增加（＜0.05），ROS含量减少，自噬小体数量减少；益气温阳活血利水方中、高剂量组H9C2细胞Beclin 1表达明显降低（＜0.05，＜0.01）。益气温阳活血利水方减少戊巴比妥钠诱导的H9C2心肌细胞损伤与抑制线粒体自噬密切相关，这可能是其治疗心力衰竭的重要机制之一。

益气温阳活血利水方；H9C2心肌细胞；线粒体自噬；心力衰竭

线粒体是真核细胞内具有双层膜结构的细胞器，线粒体氧化磷酸化成为心肌细胞提供能量的主要场所。线粒体质量控制是维持线粒体的结构完整性和功能稳定性的基础，是细胞免受线粒体损害的重要防御机制[1]。线粒体自噬是细胞依赖溶酶体对线粒体降解过程，是细胞自噬的重要组成部分，可有效清除功能失调的线粒体，保持线粒体完整性[2]。心力衰竭是心肌能量代谢重塑和心室重塑，线粒体自噬功能失调会导致心力衰竭的进展。因此，从线粒体自噬研究心力衰竭的发病机制具有重要的临床意义。本课题组前期临床研究表明，在规范抗心力衰竭西药治疗的基础上加用益气温阳活血利水中药治疗慢性心力衰竭，在中医证候积分、早期改善心力衰竭患者的运动耐力及明尼苏达心力衰竭生活质量评分方面较单纯西药治疗组有显著优势，且证候改善及6分钟步行试验提高较空白对照组提前1周出现，提示应用中医药干预治疗可改善心力衰竭的症状，并可提高慢性心力衰竭患者的生存质量[3-4]。但是从线粒体自噬角度研究益气温阳活血利水方对心力衰竭的干预作用较少。因此，本研究通过戊巴比妥钠诱导方法建立H9C2心肌细胞线粒体自噬模型，观察益气温阳活血利水方对戊巴比妥钠诱导的H9C2心肌细胞线粒体自噬的影响。

1 材料与方法

1.1 药物及制备

益气温阳活血利水方（党参30 g，黄芪30 g，丹参20 g，赤芍15 g，桑白皮15 g，葶苈子15 g，车前子15 g，益母草15 g，泽兰15 g，泽泻15 g，制附片6 g，茯苓15 g），饮片购自中国中医科学院望京医院中药房，加10倍量水，50%乙醇回流提取3次，每次1 h，过滤，合并提取液，减压浓缩，60 ℃减压干燥，即得复方干浸膏，由北京中医药大学中药学院制备。原药材含量约为4.3 g/g干膏粉。去乙酰毛花苷，成都贝特药业有限公司，批号181001。

1.2 细胞和试剂

H9C2大鼠心肌细胞株，购于中国医学科学院细胞资源中心。三磷酸腺苷（ATP）试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号A095-2-1），活性氧（ROS）试剂盒（美国SIGMA-ALDRICH公司，货号MAK114），兔Beclin 1多克隆抗体（英国Abcam公司，货号ab55878），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（上海碧云天生物技术有限公司，货号A0208），戊二醛溶液（美国SIGMA-ALDRICH公司，货号G5882），高效RIPA组织/细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司，货号S3568）。

1.3 仪器

超净工作台（新加坡ESCO公司，型号SVE-4A1），CO2细胞培养箱（日本三洋公司，型号MCO-20AIC），精密pH计（英国Mettler-Toledo公司，型号Delta320），倒置相差显微镜及成像系统（德国Leica公司，型号4000B），低温高速离心机（德国Heraeus公司，型号sepatechbiofuge 28RS），透射电子显微镜（日本日立公司，型号H7650），LKB-V超薄切片机（德国Leica公司，型号emuc-6）。

1.4 造模、分组及给药

将H9C2大鼠心肌细胞株接种于含10%胎牛血清DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2潮湿培养箱中培养，待细胞长满瓶底85%左右，加胰蛋白酶消化，按照1∶2进行传代培养和细胞冻存。将培养好的心肌细胞置于培养皿中培养，细胞贴壁后，待细胞长满瓶底70%～80%，加入0.8%戊巴比妥钠至H9C2心肌细胞各规格培养板中，作用7 min，得到H9C2心肌细胞损伤模型。

根据CCK-8实验结果，将细胞分为空白对照组、模型组（0.8%戊巴比妥钠）、阳性药组（1.6 mg/L去乙酰毛花苷）、中药低剂量组（200 mg/L益气温阳活血利水方醇提物）、中药中剂量组（300 mg/L益气温阳活血利水方醇提物）、中药高剂量组（400 mg/L益气温阳活血利水方醇提物）。各给药组给予相应剂量药物干预4 h，细胞0.25%胰酶消化，4 ℃、1500 r/min离心5 min，进行相关检测。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖

96孔板接种细胞6×103～8×103个，体积100 μL，置于37 ℃培养箱培养24 h，待细胞融合达70%左右，每孔加入10 μL CCK-8液，置于37 ℃培养箱孵育2 h，于酶标仪波长450 nm处检测光密度值。结果见表1、表2。

表1 不同浓度益气活血利水方作用于H9C2心肌细胞损伤模型CCK8值比较（±s）

注：与模型组比较，##＜0.01

表2 不同浓度去乙酰毛花苷作用于H9C2心肌细胞损伤模型CCK8值比较（±s）

注：与模型组比较，#＜0.05，##＜0.01

1.6 自噬小体形态学观察

收集药物干预4 h H9C2心肌细胞，制备细胞混悬液，PBS漂洗2次，离心成团，EP管中加2%戊二醛，4 ℃固定过夜，PBS漂洗，1%锇酸固定，1%醋酸铀负染，梯度丙酮脱水，包埋液包埋固化，半薄切片及甲苯胺蓝染色进行定位，LKB-V超薄切片机超薄切片，透射电镜观察H9C2细胞形态。

1.7 心肌细胞形态学、线粒体结构观察

按“1.6”项下方法制备细胞混悬液，运用倒置显微镜观察心肌细胞损伤模型细胞形态学，运用透射电子显微镜观察心肌细胞损伤模型线粒体超微结构。

1.8 心肌细胞三磷酸腺苷、活性氧测定

将H9C2心肌细胞种接种于24孔培养板，置于37 ℃培养箱培养24 h，待细胞融合达70%左右，造模后向每孔内加入药物4 h，然后加入ATP裂解液裂解，4000 r/min离心5 min，运用ATP试剂盒检测心肌细胞损伤模型ATP浓度。采用DCFH-DA法检测H9C2心肌细胞内ROS相对含量。使用无血清的DMEM培养基稀释DCFH-DA（终浓度为10 μmol/L）。将H9C2心肌细胞种接种于96孔培养板，造模后向每孔内加入药物4 h，PBS清洗细胞，吸弃上清，加入DCFH-DA稀释液覆盖细胞，37 ℃培养箱中孵育30 min，PBS清洗细胞2次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，收集细胞。使用显微镜检测荧光强度，平均荧光信号强度代表相对ROS含量。

1.9 Western blot检测心肌细胞Beclin 1蛋白表达

RIPA蛋白抽提试剂提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量，调整蛋白浓度，煮沸变性5 min，10%SDS- PAGE电泳后半干转印仪转膜，5%BSA-TBST封闭1 h，按比例稀释Beclin 1（1︰500）、LC3B（1︰1000）一抗，4 ℃水平摇床孵育过夜，山羊抗兔IgG（H+L）二抗1︰3000室温孵育40 min，上机荧光扫描，以GAPDH为内参。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 益气活血利水方对H9C2心肌细胞线粒体超微结构的影响

模型组可见H9C2心肌细胞线粒体边界模糊不清，体积明显肿胀，基质密度降低，部分线粒体内膜破裂、嵴疏松溶解甚至嵴断裂现象，可见空泡样变；与模型组比较，中药各剂量组和阳性药组H9C2心肌细胞线粒体边界较清晰，肿胀缓解，空泡明显减少。见图1。

图1 各组H9C2心肌细胞线粒体超微结构（×30 000）

2.2 益气活血利水方对H9C2心肌细胞三磷酸腺苷、活性氧水平的影响

与模型组比较，中药低、高剂量组H9C2心肌细胞ATP含量明显增加，差异有统计学意义（＜0.01），见表3。荧光强弱反映线粒体活性氧的水平，模型组H9C2心肌细胞荧光明显增强，ROS含量明显增加；与模型组比较，中药高、中、低剂量组和阳性药组H9C2心肌细胞荧光强度明显减弱，ROS含量明显降低，见图2。

2.3 益气活血利水方对H9C2心肌细胞自噬体的影响

与模型组比较，中药高、中、低剂量组和阳性药组H9C2心肌细胞线粒体肿胀缓解，自噬小体数量减少（箭头所指），空泡含量减少，线粒体膜较完整，见图3。

表3 各组H9C2心肌细胞ATP含量比较（±s）

注：与模型组比较，#＜0.05，##＜0.01

图2 各组H9C2心肌细胞ROS阳性表达（荧光探针，×200）

图3 各组H9C2心肌细胞线粒体自噬变化（×30 000）

2.4 益气活血利水方对H9C2心肌细胞对Beclin 1蛋白表达的影响

与模型组比较，中药中、高剂量组和阳性药组H9C2心肌细胞Beclin 1蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。见表4、图4。

表4 各组H9C2心肌细胞Beclin 1蛋白表达比较（±s）

注：与模型组比较，#＜0.05，##＜0.01

注：A.空白对照组；B.模型组；C.中药低剂量组；D.中药中剂量组；E.中药高剂量组；F.阳性药组

3 讨论

线粒体是心肌细胞的能量工厂，产生能量的同时也生成ROS，尤其是线粒体损伤时，线粒体功能下降，产生过多的ROS，出现DNA、蛋白质、脂质损伤，导致细胞程序性死亡、炎症和衰老。线粒体自噬对维持线粒体的正常功能有重要作用，其失调导致线粒体异常堆积，引起心肌细胞死亡和收缩功能障碍，最终导致心力衰竭。本研究发现，戊巴比妥钠诱导H9C2心肌细胞损伤后ATP水平下降，ROS水平明显升高，线粒体超微结构明显破坏。与戊巴比妥钠诱导的H9C2心肌细胞损伤模型组比较，益气温阳活血利水方干预后ATP含量增加，ROS水平下降，线粒体边界较清晰，肿胀缓解，空泡明显减少，提示益气温阳活血利水方有维持线粒体正常结构、促进能量产生、减少氧化应激产物的作用。

益气温阳活血利水方为郭维琴教授和霍艳明主任医师临床经验方，方中党参、黄芪补益心气，附子温阳通脉以治本，丹参、赤芍、泽兰活血化瘀，茯苓、桑白皮、葶苈子、车前子、泽泻利水消肿以治标。沈淑静等[5]采用腹主动脉缩窄法制作压力超负荷性心力衰竭兔模型，研究表明益气温阳活血利水中药可改善心力衰竭兔血流动力学指标，保护心脏收缩功能，延缓心力衰竭发展。黄平东等[6]实验研究发现，益气温阳活血利水药可明显降低模型大鼠心室重量指数和基质金属蛋白酶活性。牟金亭等[7]临床研究发现，中药治疗组患者左室舒张末期内径明显缩小，舒张末室间隔厚度明显下降，左室射血分数显著提高，疗效明显优于西药综合治疗组。冯伟等[8]临床研究发现，治疗组在常规治疗基础上加用益气温阳活血利水方，不仅提高心肾综合征患者射血分数，降低B型利钠肽水平，且改善肾脏功能。也有学者临床研究发现，在西药基础上加服益气温阳活血利水中药治疗慢性充血性心力衰竭疗效确切，能有效改善患者症状，调节神经内分泌，降低白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、超敏C反应蛋白水平[9]。张良等[10]临床研究发现，在常规治疗基础上联合益气温阳活血利水法可提高慢性心力衰竭临床疗效，改善循环miR-423-5p表达水平。邓坤[11]通过对2008－2018年益气温阳活血利水中药治疗慢性心力衰竭的随机对照研究文献进行Meta分析发现，益气温阳活血利水中药联合西药可减小左室舒张末内径，提高左室射血分数，增加6分钟步行距离，提高临床综合疗效。吴献等[12]通过对益气温阳活血利水法治疗慢性心力衰竭文献研究发现，益气温阳活血利水法可改善心功能，延缓心室重构，提高生活质量和改善远期预后。大量基础、临床研究及文献综述表明，益气温阳活血利水中药具有改善心力衰竭症状、保护缺血心肌、抑制心室重塑、改善心功能、提高生活质量、改善远期预后的作用。

有关益气温阳活血利水中药防治心力衰竭体外研究较少。体外研究细胞干预方式目前主要包括药物血清和直接加药法。其中血清中内源性活性物质虽然灭活，但仍可能影响体外细胞、组织的生物活性，出现假阳性或假阴性结果。直接加药法是采用中药提取物或提取部位干预体外模型，中药提取物中杂质对细胞活性影响较大，因此，中药的加工工艺尤为重要。本实验药物通过多次醇提和蒸馏后所含杂质相对较少。前期体内及体外研究发现，人参三七川芎醇提物可延缓大鼠衰老、内皮和平滑肌细胞衰老[13-15]。本研究发现，益气温阳活血利水方可缓解线粒体肿胀缓，减少自噬小体和空泡含量，改善线粒体膜完整性，从而降低戊巴比妥钠诱导H9C2心肌细胞损伤，这可能与抑制线粒体自噬的过度激活、降低自噬蛋白Beclin 1表达密切相关。

综上，益气温阳活血利水方可通过抑制线粒体自噬、提高ATP水平、减少ROS产生，达到减少戊巴比妥钠诱导的H9C2心肌细胞损伤作用，其抑制线粒体自噬作用的相关机制应从心力衰竭调节的相关蛋白和线粒体膜外蛋白的调节作用方面进行研究。

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Effects ofPrescription on Pentobarbital Sodium-induced Mitophagy in H9C2 Cardiomyocytes

WANG Qiang1, YANG Jing2, XIU Chengkui2, SUN Wei1, LI Qilin1, YU Jie1, WANG Huiqi1, HUO Yanming1

To observe the effects ofPrescription on pentobarbital sodium-induced mitophagy in H9C2 cardiomyocytes.An H9C2 cardiomyocyte autophagy model was established by pentobarbital sodium induction method. The experiment was divided into blank control group, model group, deacetylethrin group andPrescription low-, medium- and high-dosage groups. Each administration group was given relevant medicine. Ultrastructures of autophagosomes and mitochondria were observed using an electron microscope, and ATP concentration of cardiomyocytes was detected by ATP kit. Reactive oxygen species (ROS) fluorescent probes were used to determine ROS content, and Western blot was used to detect the expression of autophagy protein Beclin 1.Compared with the model group, the mitochondrial boundary of H9C2 cells was clearer, the swelling of mitochondria was relieved, the vacuoles of mitochondria were significantly reduced, the content of ATP increased (<0.05), the content of ROS decreased, and the number of autophagosomes decreased after the intervention ofPrescription; the protein expression of Beclin 1 inPrescription medium- and high-dosage groups decreased significantly (<0.05,<0.01).Reducing pentobarbital sodium-induced H9C2 cells damage byPrescription is closely related to the inhibition of mitophagy, which may be one of its important mechanisms for treating heart failure.

Prescription; H9C2 cardiomyocytes; mitophagy; heart failure

R285.5

A

1005-5304(2020)12-0043-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004531

国家自然科学基金（81703865）；北京市科委重大专项（z171100001017108）

霍艳明，E-mail：huoym98@163.com

（2020-04-22）

（2020-05-18；编辑：华强）