常温机械灌注设备对供肝热缺血损伤保护作用的实验研究

刘华敏，何锡然，谭晓宇，张琳，邝伟键，梁铭炬，周伟津，郭家钘，陈素平，黄小桃，霍枫

1. 广东顺德工业设计研究院（广东顺德创新设计研究院），广东 佛山 528311；2. 中国人民解放军南部战区总医院 肝胆外科，广东 广州 510010；3. 广东丁沃生医疗器械有限公司，广东 佛山 528311

引言

肝移植是终末期肝病最有效的治疗方法，由于供体器官的短缺，该技术的发展受到严重制约。为扩大供应器官来源，心脏死亡供体捐献（Donation After Circulatory Death，DCD）逐渐受到重视。但DCD供肝在获取前经历了低灌注、缺氧的过程，造成不同程度的热缺血损伤，增加了移植后原发性肝无功（Primary Nonfunction，PNF）和胆管性病变等并发症发生的风险[1-4]。使用传统的静态冷保存（Static Cold Storage，CSC）方法将会进一步加重DCD供肝损伤[5-6]，致使很多的供肝废弃。因此，在扩大供肝来源的同时，离体器官的保存和维护的方式被赋予更高的要求。

随着体外机械灌注技术的发展，研究者使用常温机械灌注（Normothermic Machine Perfusion，NMP）技术改善、扩大标准供体器官的保存状态[7]。NMP是以机械方式在生理温度下为器官提供血液灌注和氧供，保证氧气和营养的供给，恢复细胞代谢的一种技术[7-9]。NMP保证了离体肝脏的正常代谢，维持肝脏的正常生理状态，避免冷藏，且能够进行肝脏功能检测。近年来，NMP已经取得明显的进展，欧洲和北美已发展到临床试验阶段[10-11]，临床前实验证明了该技术具有安全性和可靠性[12-13]。目前国内还没有市场化的肝脏NMP设备，国外也仅处于获得欧盟认证阶段。基于国内供肝日趋紧缺，越来越多边缘性供体用于临床移植，而国内NMP设备尚在探索阶段，因此本项目组自主研发了一套新型的离体肝脏NMP设备，拟通过构造DCD 30 min和DCD 60 min实验模型，初步探究该设备保存猪DCD肝脏的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

1.1.1 实验动物

选取健康巴马小型猪9只，雌性，体重40～50 kg，由中国人民解放军南部战区总医院实验动物中心提供。实验操作过程严格遵照中国人民解放军南部战区总医院的动物实验伦理要求。

1.1.2 NMP设备

NMP设备DEVOCEAN-LIVER 2000，该设备由广东顺德工业设计研究院（广东顺德创新设计研究院）、解放军南部战区总医院、广东丁沃生医疗器械有限公司联合研发。该设备可对离体肝脏进行肝动脉和门静脉双重灌注。主要构建部件有：2个离心泵头（Revolution Centrifugal Pump，Sorin Group Italia S.r.l.）；2个 氧 合 器（EUROST EU5032 TRILLY Infant-Paediatric Oxygenator，EUROSETS S.r.l.）；1个温度传感器（精密型，佛山市亨远电子有限公司）；2个一次性使用压力传感器（洛瑞，深圳市顺美医疗股份有限公司）；2个流量传感器（co.56/080，SONOTEC GmbH）；2个一次性使用动脉微栓过滤器（儿童，东莞科威医疗器械有限公司）；温控水浴箱；自制储肝器、自制灌注管路以及自制门静脉、肝动脉、胆管插管等构成，通过管路连接形成肝动脉循环和门静脉循环。在中国人民解放军南部战区总医院实验动物中心，实验室常温状态下对猪DCD肝脏进行常温灌注如图1所示。

1.1.3 NMP灌注液的配制

总体积为1.5 L，包括猪全血，羟乙基淀粉130/0.4电解质注射液，800 U肝素钠注射液，1 g注射用头孢西丁钠，500 mg注射用甲泼尼龙琥珀酸钠。灌注过程的药物添加如下：① 盐酸维拉帕米注射液0.25 mg/h经肝动脉泵入；② 注射用尿激酶20万单位经肝动脉泵入；③50 mL复方氨基酸注射液混合复合维生素注射液2 mL，5 mL/h经由门静脉泵入；④ 胰岛素10 U/h门静脉泵入；⑤牛磺胆酸钠（140 mg/mL）1 mL/h经由门静脉泵入。

图1 离体肝脏NMP系统原理图

1.2 实验分组

所有实验猪的肝脏根据热缺血时间分为两组，分别为DCD 60 min组（n=5）和DCD 30 min组（n=4）。

1.3 实验方法

1.3.1 猪血液及肝脏获取

在耳后肌肉注射0.05 mg/kg硫酸阿托品注射液，15 min后按照 1～2 mg/kg的量注射舒泰50，进行基础麻醉。麻醉成功后，肌肉注射 5 mg 咪达唑仑注射液。诱导麻醉后，耳缘静脉留置套管针建立输液通道。微量注射泵以每小时2～5 mg/kg的剂量泵入丙泊酚注射液维持麻醉。然后进行气管插管，连接呼吸机，潮气量设定为10 mL/kg。腹部正中切口开腹，离断肝周韧带，横断并结扎胆总管，游离肝动脉和门静脉。经耳缘静脉注射25000 U肝素钠注射液和2～3 mg盐酸多巴胺注射液，随后于肾门水平以下的腹主动脉和下腔静脉分别置入16-Fr导管进行血液的收集，血液储存袋预先加入12500 U肝素钠和8 mL生理盐水混合液进行抗凝。将收集的血液进行过滤，去除全血中的白细胞。以血液引出的当刻为热缺血时间计时起点，静置实验猪60 min或30 min。热缺血时间结束后，结扎胸主动脉，经腹主动脉插管，用1 L，4℃的高渗枸橼酸盐嘌呤溶液灌注液进行在体冷灌注。同时，进行门静脉插管，灌注1 L，4℃的高渗枸橼酸盐嘌呤溶液灌注液。快速取下肝脏并置入无菌保护袋中，称量肝重，然后移至含冰生理盐水的储肝器中进行修肝，最后在肝动脉和胆道置入连接设备的导管。

1.3.2 NMP

开始灌注之前灌注管路内用羟乙基淀粉130/0.4电解质注射液混合部分全血进行预充，排除管路中的气泡。随后加入全血、肝素钠注射液、注射用头孢西丁钠和注射用甲泼尼龙琥珀酸钠，开始供氧。将修整好的肝脏连接设备。记录冷缺血时间（从在体冷灌注至机械灌注开始所需的时间）。肝动脉采用压力控制模式灌注，收缩压力设定为80 mmHg，舒张压设定为60 mmHg。门静脉采用流量控制模式灌注，流量设定为0.5 mL/[min·g（肝重）]。

1.3.3 监测项目

灌注过程记录肝动脉流量、肝动脉压力、门静脉流量以及门静脉压力，同时对灌注液行血气及生化分析，观察pH、血糖（Glucose，Glu）、乳酸（Lactate，Lac）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸转氨酶（Aspartate transaminase，AST）、总胆红素（Total bilirubin，TBIL）、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-Glutamyl Transpeptadase，γGGT）浓度。记录灌注过程中每小时产生的胆汁量，并检测胆汁的pH、碳酸氢根水平（HCO3-）、葡萄糖、胆红素和胆汁酸。

1.4 统计分析

采用SPSS 23.0统计学软件进行统计学分析。所有计量资料以平均数±标准差（±s）表示，样本服从正态分布，采用配对t检验，若样本不服从正态分布则采用非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 灌注前参数

DCD 60 min组的平均冷缺血时间为（79.83±3.53 ）min，DCD 30 min组为（88.50±8.18） min，两组比较差异无统计意义（P＞0.05）。机械灌注前，DCD 60 min组灌注液的红细胞比容（Hematocrit，HCT）为（31.17±1.01）%，DCD 30 min组的HCT为（31.00±0.58）%，两组的HCT水平比较，无统计学差异（P＞0.05）。

2.2 物理参数

灌注过程中，两组的肝动脉压力均维持在80/60 mmHg。两组的肝动脉流量水平接近，无统计学差异（P＞0.05）。两组的门静脉灌注流量均为0.5 mL/[min·g（肝重）]，而DCD 30 min组的门静脉灌注压力随灌注时间延长呈现下降趋势。在灌注的第6～12小时，两组的门静脉压力比较，差异有统计学意义（P＜0.05），结果如图2所示。

2.3 血气生化分析

灌注过程中，两组的灌注液pH总体保持平稳，未出现过酸或过碱的情况，无统计学差异（P＞0.05）。两组的Lac代谢变化趋势相似。在灌注1～6 h中，DCD 30 min组的Lac水平略高，但无统计学差异（P＞0.05），在灌注7 h至结束Lac水平均下降至2 mmol/L。在Glu代谢方面，两组均表现良好。在灌注过程中葡萄糖持续消耗，两组水平相比，无统计学差异（P＞0.05）。在蛋白质代谢方面，由于肝脏持续进行蛋白质代谢，故两组的BUN水平均持续升高，DCD 60 min组上升更高，两组在第8、11、12 h水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果如图3所示。

在肝功能方面，两组的ALT和AST水平均在灌注开始后上升，而DCD 60 min组的水平较DCD 30 min组升高明显，其中两组的ALT水平从灌注2 h至灌注结束的每个时间点均有统计学差异（P＜0.05），AST水平自1 h 至灌注结束有统计学差异（P＜0.05）。在反映胆汁淤积损伤方面，两组的ALP和γGGT水平相似（P＞0.05）。而两组的TBIL水平除了在灌注1h有统计学差异（P＜0.05），其余灌注时间点均无统计学差异（P＞0.05）。结果如图4所示。

图2 灌注参数

图3 血气生化指标

图4 血气生化指标

2.4 胆汁指标

两组在灌注过程均可持续生成胆汁，DCD 60 min组和DCD 30 min组灌注12 h的平均胆汁总量分别为（163.75±12.00） mL 和（159.75±10.96 ）mL（P＞0.05），两组平均每小时生成胆汁量达10 mL以上。其中DCD 30 min肝脏在灌注0～2 h内生成更多的胆汁（P＜0.05）。两组的胆汁pH均呈弱碱性，在7.3～7.4，两组之间无统计学差异（P＞0.05）。两组的HCO3-水平，无统计学差异（P＞0.05），平均在10 mmol/L左右。两组的胆汁葡萄糖水平均呈持续下降趋势，两组之间无统计学意义（P＞0.05）。而胆汁的TBIL和胆汁酸浓度方面，两组在灌注后期出现统计学差异，其中DCD 30 min组在灌注8～12 h的TBIL浓度更高，在灌注10～12 h的胆汁酸浓度更高，结果如图5所示。

图5 胆汁指标

3 讨论

DCD供肝在获取前因供体循环不稳定而遭受较长时间的缺血、缺氧打击，致使器官功能受损。目前，迫于日趋严重的器官短缺困境，DCD 供肝在移植中的使用不断增多，由此引发的术后原发性无功能和缺血性胆病等严重并发症也频繁发生。对比传统的CSC技术，NMP可以模拟肝脏的在体生理条件，维持离体肝脏组织正常机能及代谢环境。目前学界正尝试使用NMP来改善DCD 来源供肝的保存状态[7]。NMP潜在的器官修复能力也引起了许多学者的关注[9,14-15]。本研究基于此技术基础搭建了新型NMP设备，并探讨该设备对猪DCD供肝的保存效果。

目前，使用NMP技术进行离体肝脏保存的灌注条件并不明确。但在肝移植中，学者们对小肝综合征的研究结果指出过高的门静脉压力和门静脉超灌是损伤肝脏损伤的主要原因[16]。本设备使用的是双泵双氧合灌注构建，可以为门静脉灌注富含氧供的血液，在较低的流量下供应足够的氧供。为保证设备中的DCD供肝免受门静脉过灌和高压的进一步损害，我们选择较低门静脉流量进行灌注，有研究报道正常肝脏血流量与肝重的比值约为1 mL/g[17]，门静脉血供约为75%，因而我们选择0.5 mL/g为门静脉恒流灌注标准。本研究采用了肝动脉搏动式恒压控制和门静脉持续恒流控制的灌注模式，在肝动脉恒压下，两组的肝动脉流量均呈现先升高，在中期达到峰值，随后出现下降的趋势。这点与其他研究结果相似。如Vogel等[18]利用由牛津大学直属公司研发的常温灌注系统OrganOx对猪脑死亡肝脏进行了48 h的常温灌注，从肝动脉流量的图表看，肝动脉流量在灌注前12 h呈下降趋势。而在OrganOx系统更早的动物实验中，常温灌注猪脑死亡肝脏72 h的肝动脉流量在灌注前10 h亦呈下降趋势[19]。Liu等[20]利用他们自主研发的灌注系统对DCD 60 min猪肝脏进行10 h的常温灌注，灌注过程中，肝动脉流量亦出现波动。综合其他实验的结果，肝动脉流量在长时间灌注过程出现波动属于普遍现象。而在门静脉保持0.5 mL/[min·g（肝重）]的恒流模式下，门静脉压力在灌注过程维持平稳，压力低于3 mmHg。Xu等[21]利用恒流模式进行门静脉灌注，流量为1.2～1.5 L/min，对应的门静脉压力为5～8 mmHg。在另一个门静脉恒流控制实验中，流量为1.5 L/min，对应的压力为5～10 mmHg[22]。综合文献的结果，在0.5 mL/[min·g（肝重）]的模式下，本研究的门静脉压力平稳，未出现过低或者过高。但是两组相比较，DCD 30 min组的门静脉灌注阻力更低，可能与其损伤导致的细胞水肿更轻有关。本研究结果初步显示在肝动脉恒压控制和门静脉恒流控制模式下，自主研发的常温灌注设备能够稳定维持灌注12 h的压力和流量，灌注过程中未出现系统故障，表明了本设备长时间运转的安全性和稳定性。

供体器官质量与热缺血时间关系密切，因而热缺血时间长短是供体受损程度评估的重要依据[23]。各个器官对热缺血时间耐受程度略有不同，一般认为供肝耐受热缺血时间为30 min[10]。本研究中，在冷缺血时间可比的情况下，DCD 60 min肝脏的转氨酶水平明显高于DCD 30 min组，显示出热缺血时间越长，肝脏的损伤越重。同时两组的ALT、AST水平在灌注过程中均呈现先升后逐渐平稳的趋势，表明DCD供肝在本设备的支持维护下没有进一步加重损伤。以上研究结果表明，热缺血时间越长对肝脏造成的损伤越严重，而NMP则可有效保存和维护DCD供肝[24-25]。

灌注过程中，两组肝脏的Lac、Glu水平在上升后回落至稳态，而BUN水平逐渐上升，表明了本设备能够维持离体进行有氧呼吸，糖代谢和蛋白质代谢的生理功能。其中DCD 30 min肝脏的Lac水平在灌注初期较高，可能该类肝脏的活细胞数更多，冷缺血期无氧呼吸产生更多Lac。在灌注初期，由于缺血性再灌注损伤，更多有功能细胞进行无氧呼吸，导致Lac水平升高。Liu等[20]研究亦出现Lac水平在灌注中期高随后回落的趋势，他们认为可能是热缺血结束灌洗后的残余量。同时本研究也尝试比较两组供肝的Lac清除率，所用的公式为：6 h动脉血Lac清除率=[（0 h动脉血Lac水平-6 h动脉血Lac水平）/0 h动脉血Lac水平]×100%，但两者的Lac清除率无统计学差异（P＞0.05）。

胆汁的产生是目前公认的肝功能正常的指标之一[26-27]。在本研究中，两组肝脏均能持续生成胆汁，两组平均每小时生成胆汁量达10 mL以上，提示肝细胞恢复了胆汁的合成和分泌功能正常[28]。对胆汁的成分进一步分析发现，胆汁pH呈弱碱性，提示胆管细胞分泌碳酸氢根的功能正常；胆汁葡萄糖水平在灌注12 h下降到2.4 mmoL以下，提示胆管细胞恢复葡萄糖的重吸收功能；而胆汁胆红素和总胆汁酸水平在灌注过程中逐渐增多，这是肝细胞摄取、转化和分泌功能开始复苏的标志[29]。其中DCD 30 min组在灌注后期产生的胆汁品质更好，提示在灌注后期DCD 30 min组的肝细胞功能较佳。可依据此类胆汁检测指标评估出肝功能较佳的肝脏。

综上，本研究结果初步显示自主研发的NMP设备在常温灌注12 h内能维持热缺血损伤肝脏的功能。但本实验尚缺少肝脏保存效果的评价标准，下一步将进行NMP灌注后的肝移植实验以探究移植后肝脏的生理病理变化，进一步验证该常温灌注设备对热缺血损伤肝脏的保护作用，为将来在临床的推广提供了重要的基础研究意义，为未来的临床应用提供了安全性的证明。