水稻全基因组测序揭示的粳稻与籼稻亚种内品种间多态性研究

陈喜娜，袁泽科，杜彦修，李俊周，张静，彭廷，赵全志，孙红正

(河南农业大学农学院，河南 郑州 450046)

图位克隆是迄今为止最为有效的克隆水稻未知基因的方法，水稻大多重要农艺性状基因都是通过图位克隆获得的[1-5]。籼稻和粳稻来自普通野生稻祖先，由于生殖隔离，籼稻与粳稻之间杂交不育或低育性一直是亚种间杂交的主要障碍[6-7]。另外，籼稻和粳稻间遗传背景差异较大导致的后代群体偏分离等现象也对目标表型鉴定造成较大的影响[8-9]。相对于亚种间杂交，亚种内杂交则不存在杂交不育或偏分离的情况，因此，亚种内杂交相对于亚种间杂交的优势不言而喻。得到足够多的多态性标记是基因图位克隆的首要条件，由于亚种间的多态性高于亚种内的多态性[10-11]，因此，在大多数图位克隆研究中，为了得到足够多的多态性分子标记，分离群体的构建都是采用籼稻和粳稻亚种间杂交的方式构建的。随着DNA测序技术的发展，全基因组测序越来越普遍，从而极大地促进了正向遗传学的发展。在2014年, 超过3 000份水稻种质资源被测序，并发现了超过2 000万个SNP(Single nucleotide polymorphism)位点[12-13]。随后的分析在3 010份种质资源测序数据中鉴定出2 900万个SNP位点、240万个InDel(Insertion/Deletion)和9万个基因组结构变异[14]。为了研究全基因组范围内亚种内和亚种间的多态性水平，本研究从水稻3K测序项目中选取了32份种质资源，分别包含了籼稻和粳稻的5种主要类型，以评价亚种内的多态性水平及其在染色体上的密度分布。

1 材料与方法

1.1 材料

32份水稻种质资源，选自3 000份水稻基因组重测序项目，包括16份籼稻和16份粳稻种质资源(表1)。其中粳稻种质资源包括4份中间类型、4份粳稻类型、4份温带粳稻类型和4份热带粳稻类型。所有种质资源的测序深度均在10倍以上。

1.2 方法

基因组测序数据下载自3KRG SNP & indel datasets release 1.0(http://oryzasnp.org/)。对亚种间和亚种内种质资源两两之间的SNP和InDel数量进行统计。使用MEGA软件对32份种质资源的SNP序列数据采用Neighbour-joining方法构建系统进化树，进化树的可靠性通过1 000次的Bootstrap进行验证。亚种内与亚种间的遗传距离使用MEGA软件中的最大复合似然方法进行计算。SNP/InDel在染色体上的密度图使用R软件包CMplot(https://github.com/YinLiLin/R-CMplot)进行绘制。

表1 本研究所用水稻种质资源列表

续表1

2 结果与分析

2.1 32份水稻种质资源的亲缘关系分析

为确定所选用水稻种质资源的亲缘关系，使用32份水稻种质资源的SNP构建系统进化树。不同种质资源的测序深度不同(表1)，虽然在32份水稻种质资源中共检测到5 280 807个SNP，但是，其中有些SNP并未在所有种质资源中被检测到，因此，经过筛选共有在所有32份种质资源都被检测的913 117个SNP被用于构建系统进化树。系统进化树显示32份水稻种质资源可以很好地被分成籼稻和粳稻两大支(图1)。其中，籼稻种质资源可以很好地聚成1支，粳稻种质资源中有4份热带种质形成1个小分支，其他温带种质、中间类型和其他类型的粳稻没有聚成单一的小分支。4份中间类型的种质资源中，粳7623(B141)和霸王鞭1(B084)位于籼稻和粳稻分支中间，但更倾向于粳稻分支。另外2份中间类型种质资源粳87-304(B124)和越光(CX330)则混于粳稻分支中，因此，在后续分析中，4份中间类型的种质资源被划分到粳稻分支中分析。

2.2 32份水稻亚种间和亚种内的SNP和InDel差异分析

在32份水稻种质资源中共发现5 280 807个多态性SNP位点和478 996个InDel位点，对每份种质资源两两之间的差异SNP和InDel数量进行统计发现，亚种间种质资源两两之间的SNP数量平均值为1 744 498个，InDel数量平均值为159 829个(图2)。

在所选用的32份种质资源中，亚种间两两种质资源多态性InDel数最少的是粤香占和粳7623(CX17-B141)，两者之间有112 101个InDel。而InDel数量最多的是魔王谷内杂和山酒谷(B095～B245)，全基因组范围内共检测到196 854个InDel。亚种间多态性SNP数量最多的组合是魔王谷内杂和徐稻4号(B095～CX251)，共有2 220 309个SNP，而SNP数量最少的组合是湘矮早10号和粳7623(B232～B141)，共有919 316个SNP(图3)。

籼稻亚种内种质资源之间平均有108 850 InDels和650 797 SNP，竹珍B和G珍汕97B(B248～B156)之间的InDel和SNP在所有籼稻组合中最少，分别为59 773和9 092。湘矮早10号与油黏(B232～B224)之间的InDel数量最多，InDel达到130 094个。明恢63与油黏之间SNP数量最多(CX145～B224)，有934 526个SNP(图3)。

粳稻亚种内种质资源两两之间平均有57 384个InDel和639 927个SNP，在所有粳稻两两组合之间，粳87-304和越光(B124～CX330)之间的InDel和SNP数量最少， SNP有153 109个，InDel有16 298个。霸王鞭1和拉木加(B084～B241)之间的InDel数量最多，有103 825个InDel。粳7623和拉木加(B141～B241)之间的SNP数量最多，有1 309 253个SNP(图3)。

遗传距离反映种质资源间亲缘关系与InDel和SNP多态性相一致，均表现为亚种间遗传距离较远，籼稻亚种内遗传距离次之，粳稻亚种内遗传距离较近(表2)。在粳稻的4个小类群内，类群内遗传距离最大的是Japonica类型的种质，中间类型的种质资源类群内遗传距离最小，而类群间遗传距离均大于类群内遗传距离。因此，在选取亚种内种质资源构建分离群体时，宜选用粳稻不同类群的种质以获得更多的多态性标记位点。

图1 32份水稻种质资源的亲缘关系树

2.3 籼稻与粳稻种质资源间SNP与InDel在染色体上的分布

为了研究粳稻与籼稻多态性SNP和InDel位点在染色体上的分布，对粳稻品种徐稻4号(CX251)和其他粳稻种质资源之间的SNP/InDel在染色体上的密度进行作图。徐稻4号与其他粳稻种质资源两两之间的InDel数目为19 833～77 765个，SNP数目有185 943～1 182 934个。在粳稻亚种内同一类型的种质资源之间SNP/InDel的密度分布图上可以看出，染色体上有较多的区域无多态性位点，而同亚种内不同类型种质资源之间的SNP/InDel位点则几乎覆盖全基因组。徐稻4号与越光均是现代粳稻品种，两者之间的多态性SNP/InDel位点中，约90%的多态性位点之间的物理距离在1 000 bp之内，最长的多态位点之间距离约1.4 Mb(图4-A)。而徐稻4号与热带类型粳稻种质资源毫马克(K)之间的多态性位点几乎覆盖了整个基因组，无明显的空白间隔区(图4-B)。

籼稻亚种内的G珍汕97B与其他籼稻种质资源的SNP/InDel位点在染色体上的分布均无明显的空白间隔区。亚种内两两种质资源之间多态性位点密度最低的是G珍汕97B和竹珍B组合(B156～B248)(图4-C)，G珍汕97B与现代籼稻品种明恢63之间的多态性位点密度同样处于较密的水平(图4-D)。

注：A为InDel数量；B为SNP数量。

注：上三角显示两两之间的SNP数量；下三角显示两两之间的InDel数量。

表2 籼稻和粳稻类群内和类群间的遗传距离

注：A：徐稻4号-越光；B：徐稻4号-毫马克(K)；C：G珍汕97B-竹珍B；D：G珍汕97B-明恢63。

3 结论与讨论

获得亲本间有多态性的分子标记是基因图位克隆的必备先决条件，自从1988年使用RFLP构建第1张水稻分子标记遗传图谱以来，分子标记的应用不断增多[15]。随着分子标记技术发展，操作烦琐的RFLP标记技术逐渐被其他基于PCR的检测技术所取代，其中最具代表性的是SSR/InDel标记检测技术。随着籼稻和粳稻亚种的基因组序列完成测序，水稻SSR/InDel标记得到了极大丰富[16]。基于PCR的检测技术方便易用性，这种分子标记方法至今仍被广泛应用。随后，新一代的SNP标记方法的出现使SNP成为遗传学研究的有力工具，SNP标记在基因组内极为丰富，可以通过DNA测序、DNA芯片和KASP等技术进行检测[17-20]。

虽然传统的基因图位克隆方法工作量极大且非常耗时，但却是揭示未知重要基因最为有效的方法[21-22]。随着QTL-Seq方法的报道，通过高通量测序技术发现新基因的进程得以极大加快[23]，这种QTL-Seq定位克隆基因的方法在模式物种水稻、玉米和拟南芥中得到广泛应用[24-27]。WAMBUGU等[28]利用非洲稻和亚洲稻的分离群体通过QTL-seq方法定位了与淀粉含量相关位于GBSSI基因的SNP位点。ARIKIT等[29]也通过该方法定位了多个与米饭延伸率、淀粉含量、糊化温度等多个QTL位点。LAHARI等[30]则通过QTL-seq方法利用F2分离群体定位了位于水稻第11染色体的水稻根结线虫病抗性QTL位点，KAMOLSUKYEUNYONG等[31]也利用该方法定位了水稻灰飞虱的抗性QTL位点。与传统图位克隆方法相比，QTL-Seq方法无需进行大量的前期引物开发和群体检测，只需要对分离群体中的极端个体混池进行测序即可对QTL位点定位。近几年来采用这种方法有大量水稻基因被克隆[32]。QTL-Seq方法另外一个较大的优势在于测序数据中可以发现大量的SNP位点，这些SNP位点在之前的传统基因定位研究中是无法高效利用的，而SNP位点在基因组中又极为丰富，即使之前被认为多态性位点较少的亲缘关系较近的种内种质资源之间也存在丰富的SNP差异位点，这些SNP差异位点都可以被用于基因定位研究。除了测序方法鉴定SNP差异位点，新的基于PCR方法也被开发出来用于SNP检测，如竞争性等位基因特异性PCR技术(KASP，Kompetitive allele-specific PCR)[33-34]。

水稻基因图位克隆研究中，使用籼稻和粳稻亚种间杂交构建分离群体是比较常见的做法，之所以选择亚种间杂交其目的就是为了更方便地筛选具有多态性的引物。从水稻全基因组重测序项目中发现，水稻亚种内的多态性也是非常丰富的。在本研究所选用的32份种质资源中，籼稻两两之间的多态性标记密度达到每Mb 280～2 614个SNP/InDel，粳稻两两之间的标记密度达到每Mb 520～3 201个SNP/InDel，这样的标记密度对基因克隆来说足够丰富。一般认为粳稻的多态性低于籼稻，但是在本研究中温带类型的粳稻类群与中间类型粳稻类群的多态性要高于籼稻亚种内多态性。因此，在基因图位克隆时，使用亚种内种质资源进行杂交构建分离群体也可能会得到足够丰富的分子标记，同时又可克服籼粳杂交带来的不利影响。在选择材料时，应尽量选用亚种内不同类型的种质资源材料以增加多态性位点。