CTLA-4基因多态性与儿童支气管哮喘易感性及血浆IFN-γ、IL-4、IgE的关系

尹继红，王晓峰，王茹

白山市中心医院，吉林白山 134300

支气管哮喘是多种炎性细胞(肥大细胞、T细胞及嗜酸性粒细胞等)及细胞因子参与的慢性气道炎症，遗传因素、环境因素等均参与哮喘的发生发展[1]。T细胞介导的免疫紊乱在过敏性疾病和哮喘发病中发挥重要作用，其中Th1型细胞可产生干扰素γ(IFN-γ)，而Th2型细胞能分泌白细胞介素4(IL-4)，当机体处于超敏状态时，T细胞功能失调，主要是Th2细胞功能亢进，导致患儿发生IgE型速发型变态反应，IgE诱导肥大细胞及嗜酸性粒细胞脱颗粒，进而释放炎性介质，导致气道高反应[2]。近年来越来越多的证据表明，共刺激分子在调节性T细胞增殖、活化及免疫等方面发挥重要调控作用，T淋巴细胞表面的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)能与树突状细胞等抗原呈递细胞表面上的B7分子结合，在调控Th1与Th2细胞分化及免疫反应程度等方面发挥重要作用[3,4]。CTLA-4又称CD152，该基因是免疫球蛋白超家族成员，包含一个可变区结构域、一个跨膜结构域和一个细胞质尾，研究表明，该基因的突变或单核苷酸多态性与糖尿病、系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等疾病易感性有关[5,6]。2017年2月～2018年2月，我们通过检测儿童血浆中CTLA-4基因 rs4553808基因单核苷酸多态性及IFN-γ、IL-4、IgE水平，分析CTLA-4基因多态性与儿童哮喘易感性及血浆IFN-γ、IL-4、IgE的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年2月～2018年2月于我院诊治的112例哮喘患儿作为病例组，其中男65例、女47例，年龄2～12(6.1±2.3)岁。纳入标准：①患儿哮喘的诊断均符合《儿童哮喘诊断标准》[7]；②患儿近期无呼吸系统感染、泌尿系统感染等感染性疾病；③患儿既往无严重心肝肺等疾病病史。排除标准：①近期无应用糖皮质激素、免疫抑制剂等药物治疗史；②合并其他免疫性疾病；③患儿家属拒绝本研究。以同期于小儿外科拟行择期手术的169例患儿作为对照组，其中男88例、女81例，年龄3～13(6.3±2.4)岁，患儿近期均无感染病史及过敏性疾病病史。两组性别、年龄差异无统计学意义(P均>0.05)。本研究经医院伦理委员会审核批准通过。所有研究对象及监护人知情同意。

1.2 CTLA-4基因 rs4553808单核苷酸多态性及血浆IFN-γ、IL-4、IgE水平检测 取两组晨起空腹静脉血约4 mL，EDTA抗凝，2 mL全血用于提取DNA，2 mL 4 ℃ 2 000 r/min离心10 min分离血浆，离心半径10 cm，检测血浆IFN-γ、IL-4、IgE。采用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)方法检测CTLA-4基因 rs4553808单核苷酸多态性。应用小剂量基因组DNA提取试剂盒(日本TaKaRa公司)提取外周血中DNA，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。应用NaroDrop检测DNA的浓度及纯度，核酸电泳鉴定其完整性，置于-20 ℃冰箱保存。CTLA-4基因 rs4553808位点基因多态性检测，正向引物5′-GGGCTATAATCACTGCTCACAGGA-3′：反向引物5′-CAGAAGAGAAAACAGTTTGGCAGC-3′。总反应体系20 μL。扩增条件：94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、62 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，共35个循环。限制性内切酶的酶切反应：反应体系包括PCR产物8 μL，核酸限制性内切酶(EcoRⅠ)2 U，反应缓冲液补足体系至10 μL。反应条件:37 ℃ 水浴，共4 h。产物进行凝胶电泳，鉴定CTLA-4 rs4553808基因型。应用ELISA法检测两组血浆IFN-γ、IL-4、IgE，实验步骤严格按照ELISA试剂盒(英国abcam公司，货号ab46025，ab215089， ab108650)说明书进行。

1.3 CTLA-4 rs4553808各基因型与哮喘并发症的关系 观察病例组哮喘急性期出现消化道反应(如消化道出血、大便潜血阳性)、呼吸系统并发症(如纵隔或皮下气肿、呼吸衰竭)、心血管系统并发症(如心率失常)、泌尿系统并发症(如肾炎)等发生情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验。采用比值比(OR)表示CTLA-4基因 rs4553808位点各基因型的哮喘易感性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组CTLA-4基因 rs4553808多态性分布比较及与哮喘易感性关系 病例组与对照组GG基因型比例分别为8.04%(9/112)、21.3%(36/169)，GA基因型比例分别为27.7%(31/112)、37.2%(63/169)，AA基因型比例分别为64.2%(72/112)、41.4%(70/169)，与对照组相比，病例组CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型比例较高(χ2=14.089，P=0.000)，而GG基因型比例较低(χ2=8.814，P=0.003)，CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型儿童支气管哮喘的易感性增加(OR=4.114，95%CI3.339～4.452，P=0.000)，CTLA-4基因 rs4553808 GA基因型儿童支气管哮喘的易感性增加(OR=1.472，95%CI：0.277～2.713，P=0.001)。病例组与对照组G等位基因频率分别为21.9%(49/224)、39.9%(135/338)，A等位基因频率分别为78.1%(175/224)、60.0%(203/338)与对照组相比，病例组CTLA-4基因 rs4553808 A等位基因频率较高(χ2=19.155，P=0.000)，CTLA-4基因 rs4553808 A等位基因型儿童支气管哮喘的易感性增加(OR=2.375，95%CI：1.796～2.993，P=0.000)。

2.2 病例组CTLA-4基因rs4553808位点各基因型与血浆IFN-γ、IL-4、IgE水平的关系 病例组GG基因型9例，血浆IFN-γ、IL-4、IgE水平分别为(22.33±4.99)ng/L、(27.45±6.91)ng/L、(34.65±7.26)×103U/L；GA基因型31例，血浆IFN-γ、IL-4、IgE水平分别为(27.67±5.23)ng/L、(35.82±7.11)ng/L、(41.44±7.89)×103U/L；AA基因型72例，血浆IFN-γ、IL-4、IgE水平分别为(35.76±6.51)ng/L、(44.20±8.21)ng/L、(49.27±8.25)×103U/L。CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型哮喘患儿血浆IFN-γ、IL-4、IgE水平分别高于GG、GA基因型(t分别为5.961、6.116，5.858、4.938，5.071、4.475，P均为0.000)，GA基因型患儿血浆IFN-γ、IL-4、IgE水平高于GG基因型(t分别为2.722、3.127、2.310，P分别为0.010、0.003、0.026)。

2.3 CTLA-4基因 rs4553808各基因型与哮喘并发症的关系 AA基因型、AG基因型及GG基因型消化道反应发生例数分别为33、2、1例，与GG基因型相比，哮喘患儿CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型并发消化道反应发生率较高(χ2=3.960，P=0.046)；AA基因型、AG基因型及GG基因型出现纵隔或皮下气肿分别为4、1、1例，出现呼吸衰竭分别为6、4、2例，出现心律失常分别为3、3、1例，出现肾炎分别为6、4、2例，出现心律失常分别为8、8、1例，各基因型在纵隔或皮下气肿、呼吸衰竭、心率失常、肾炎等并发症间差异无统计学意义(χ2分别为0.426、1.734、0.861、0.316，P分别为0.513、0.188、0.324、0.573)。

3 讨论

哮喘是一种气道异质性疾病，涉及慢性炎症、气道功能下降和组织重塑等病理生理学过程。全球范围内，哮喘患病率为1%～18%，WHO估计全世界约有3亿人受到影响，并预计到2025年将达到4亿[8]。哮喘的发生发展取决于遗传和环境因素间的复杂相互作用，环境因素如过敏原和呼吸道感染的病原微生物等，遗传因素如遗传易感性局部黏膜中免疫球蛋白E(IgE)的增加、Th2细胞功能状态等[9]。CTLA-4基因位于人类染色体2q33，该位点还包含T淋巴细胞免疫调节的两个重要基因：CD28和诱导型共刺激物(ICOS)。CTLA-4基因编码的蛋白是一种表达于活化T细胞表面的糖蛋白受体，胞外段以二硫键结合形成同源性二聚体，二聚体表面有B7配体的结合位点，B7配体包括B7-1、B7-2和B7-3。CTLA-4结合配体后能通过阻断CD28分子介导的T细胞激活发挥抑制T细胞活化的功能，参与正常机体免疫反应的负向调控。研究表明，在系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中均存在CTLA-4表达降低或功能失调的现象，可能是CTLA-4表达降低后自身免疫耐受功能丧失，自身抗体及淋巴细胞过度活化破坏机体正常细胞，导致自身免疫性疾病的发生[10]。

本研究中，支气管哮喘患儿CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型比例较高，且A等位基因频率较高，表明CTLA-4基因 rs4553808 A等位基因型与支气管哮喘的遗传易感性有关，CTLA-4基因 rs4553808 A基因型可能增加儿童支气管哮喘的易感性，与以往研究报道一致[11]。原因可能是CTLA-4基因 rs4553808基因位点位于基因启动子区上游约1 500 bp位置，而该区域含有很多潜在的顺式作用元件，特别是增强子元件，这些元件主要位于基因5′端侧翼的转录调控区内，能促进CTLA-4基因表达，而基因突变或基因单核苷酸多态性，如A>G均会导致CTLA-4蛋白功能活性下降或丧失，导致T细胞的过度激活，促进哮喘的发生[12]，但CTLA-4基因 rs4553808的基因位点功能有待进一步研究确认。此外，本研究中CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型哮喘患儿血浆IFN-γ、IL-4、IgE水平分别高于GG、GA基因型，且GA基因型患儿血浆IFN-γ、IL-4、IgE水平高于GG基因型，其机制可能是CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型增加了儿童支气管哮喘的易感性，促进T细胞向Th1和Th2亚型分化，Th1亚型促进IFN-γ的表达，而Th2亚型在促进IL-4表达的同时，招募并活化B细胞产生IgE[13,14]。另一方面，IFN-γ水平升高又进一步促进CTLA-4基因表达。研究表明，IFN-γ能激活下游信号通路中转录因子，结合到CTLA-4基因上游的启动子区域，发挥促进CTLA-4基因表达的作用[15,16]，从而在IFN-γ和CTLA-4之间形成正反馈环路，促进哮喘的发展。本研究进一步分析CTLA-4基因 rs4553808各基因型与哮喘儿童并发症的关系，结果发现，哮喘患儿CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型并发消化道反应的风险较高，而与呼吸衰竭、心率失常、肾炎等并发症无关，表明CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型可能有助于预测消化道反应的发生，其原因可能是哮喘发生时全身处于炎症反应的状态，进而引起胃肠道功能紊乱，引起腹痛、呕吐及腹泻等临床症状[17,12]。

综上所述，CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型及A等位基因增加哮喘患儿的易感性，CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型与患儿血浆IFN-γ、IL-4、IgE水平有关。但本研究样本例数较少，且仅研究单核苷酸多态中的一种功能性变异，支气管哮喘发生发展的机制有待进一步深入研究。