骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死的研究进展

袁银鹏，王新军，王宇泽

山西医科大学，太原030001

股骨头坏死(ONFH)是一种临床常见病和多发病，治疗难度大，且发病率逐年升高，在我国，15岁及以上普通人群中约有812万人患有非创伤性股骨头缺血坏死(ANFH)，各种创伤进一步提高了ANFH的发生率。临床表现为患者患侧下肢疼痛难忍，活动受限，严重影响患者的学习、工作和生活。目前，有关ONFH形成因素的假说很多，但确切机制尚不清楚，公认的有长期大量饮酒、长期大剂量使用糖皮质激素、车祸伤、老年人意外摔伤等多种因素。研究普遍认为，以上这些病因导致股骨头内高压或股骨头内营养血管堵塞，从而导致血液供应不足，最终发展为ONFH[1]。由于股骨头内部血液供应中断，导致骨组织细胞死亡，并出现腔隙，随着时间的推移，与骨细胞死亡相关的水肿增加了局部骨间压力，并影响血运重建，致使破骨细胞骨吸收与成骨细胞骨形成出现不平衡，进而降低了修复界面小梁骨的力学性能，导致骨小梁在正常负荷下微骨折发生，最终导致股骨头不可逆塌陷。目前，ONFH尚无特异性的临床治疗方法，主要治疗措施依据ONFH的临床分期及患者情况而定。对于Ⅲ期和Ⅳ期，股骨头塌陷严重、髋关节毁损且严重影响生活质量的患者，主要治疗方法是髓芯减压术[2]、自体髂骨打压植骨[3]、人工关节置换术[4]。对于Ⅰ期和Ⅱ期的早期ONFH，股骨头轮廓良好、未塌陷或尚未发现明显塌陷者，主要以高压氧、体外冲击波、脉冲电磁场、限制负重、口服药物、针灸等方法治疗，但其治疗效果有限。随着组织工程技术的发展，在ONFH区域移植骨髓间充质干细胞 (BMSCs)已成为ONFH治疗研究的热点。现就BMSCs治疗ONFH的研究进展综述如下。

1 BMSCs的生物学特性

BMSCs是骨髓间质中的成纤维样细胞，从骨髓分离并在体外培养的BMSCs形态主要为梭形或纺锤形，核质比大。BMSCs是干细胞家族中的一员，具有干细胞的共性，即培养过程中贴壁生长、能自我更新、增殖能力强；体外条件培养基中，能被定向诱导分化成成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、神经元细胞等；体内应用干细胞治疗组织缺损损伤时，干细胞可以向局部相应的组织迁移并分化为局部组织特定细胞，进而起到修复功能[5]。体外培养的BMSCs表型鉴定证实，BMSCs表面标志物表达CD105、CD73、CD90，不表达 CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、HLA-DR等[6]。

2 ONFH的发病机制

尽管ONFH的确切病因以及相关机制尚未清楚，但目前普遍认为ONFH是由各种因素共同导致股骨头营养供应中断的结果，由于ONFH像极了心脏缺血的状态，所以有时被称为“髋关节冠状动脉疾病”[1]。当股骨头内部营养供应中断后，局部骨组织微环境也随之发生变化，导致骨组织细胞死亡，引起局部水肿，局部骨间室压力增加，并进一步抑制股骨头坏死局部血液营养的供应[1]。而死亡的骨组织促进了破骨细胞活性增强，进而提高局部坏死骨组织的清理，从而破坏破骨细胞促进骨吸收与成骨细胞促进骨形成之间的平衡，降低了修复界面小梁骨的力学性能，正常负荷下发生小梁骨折，导致股骨头不可逆塌陷[1]；同时，ONFH区域BMSCs干性相关基因表达明显降低、成骨能力显著下降而成脂能力却明显增强[7]。这使得股骨头内BMSCs增殖分化为骨组织修复骨坏死区域的可能性极低，由此，外源性BMSCs治疗ONFH改善局部微环境逆转病情成为治疗早期ONFH新策略。

3 BMSCs治疗早期ONFH的机制

3.1 BMSCs调节破骨细胞功能 破骨细胞能在金属基质蛋白酶(MMP)的协助下高效溶解羟基磷灰石晶体、分解胶原纤维，促进骨基质吸收[8]。而BMSCs在调节破骨细胞的功能活性方面有重要作用。破骨细胞主要源于骨髓造血干细胞，其细胞膜上存在RANK受体，在周围环境中主要受到核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)/核因子-κB受体激活子(PANK)/骨保护素(OPG)轴(RANKL/RANK/OPG轴)的调控，RANKL和OPG相互竞争性结合破骨细胞膜上的RANK受体，进而调节破骨细胞分化成熟方向[8]。RANKL主要由骨细胞、T细胞和B细胞分泌，当其与RANK 受体结合后激活NF-κB通路促使破骨细胞分化成熟[8]。此外，巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)在促进破骨细胞分化成熟过程中发挥重要作用。相反，当OPG结合 RANK受体，破骨细胞的分化将会受到抑制，进而影响破骨细胞的成熟。在正常生理状态下，将BMSCs与破骨前体细胞共培养时可以促进破骨细胞分化成熟[8]，而M-CSF和RANKL可以剂量依赖性方式增强BMSCs促进破骨细胞发育成熟[9]。

BMSCs除了促进破骨细胞成熟外，亦能抑制破骨细胞的形成。当成骨细胞系的条件培养基(htROSCM)中加入BMSCs时，破骨细胞的形成则受到抑制。有研究证实CD200+的 BMSCs 群体表现出很强的抑制破骨细胞形成的作用[8]。BMSCs主要通过OPG的表达调控来抑制破骨细胞形成，ONFH发生过程中，破骨细胞吞噬骨组织导致局部骨质丢失或形成骨缺损，而启动自体BMSCs修复骨缺损时，在修复区OPG表达明显增加，抑制破骨细胞活性，加强成骨细胞的功能[10]。此外，外源性给予BMSCs治疗ONFH时，能显著升高OPG水平从而抑制破骨细胞活性[10]。

3.2 BMSCs向成骨方向分化填补骨缺损 BMSCs高度的分化潜能迁移至骨缺损部位，我们称之为“干细胞的归巢”，干细胞归巢到局部后依靠其高度的增殖分化能力分化为成骨细胞，填补缺损[11,12]。有证据表明，MSC亚群可能具有不同的特征和再生潜能，并且不同的亚群具有促进成骨细胞或软骨细胞分化的不同潜能[13]。与表面标记物CD105表达量高或未表达CD105的BMSCs相比，表面标记物CD105表达量低的BMSCs在成骨分化和骨再生方面作用更强，这种作用可能是由于TGF-β1/Smad2信号因子表达量降低有关(CD105表达量高会持续增加TGF-β1/Smad2信号因子的表达而降低BMSCs在成骨分化和骨再生方面的作用)[14]。进一步研究认为CD105阴性细胞比CD105阳性细胞表现出更强的酸性分泌蛋白表达，富含半胱氨酸(SPARC)和骨连素，这能更加有效地促进钙沉积而促进骨再生[15]。

3.3 BMSCs的分泌功能促进ONFH区血管形成 目前普遍认为，ONFH发生的根本原因是各种致病因素导致股骨头内部营养血管供应障碍。如果改善局部血供提供营养将能逆转ONFH病情，促进坏死区骨再生修复。Wang等[8]研究发现，在诱导培养基中进行干细胞诱导培养时，BMSCs能向血管内皮细胞分化。同时，体外和体内实验研究发现，部分药物或生物材料能诱导BMSCs向血管内皮细胞方向分化，如双相磷酸钙陶瓷、辛伐他汀[16]，它们联合BMSCs能使ONFH骨坏死区域发生血管再生，为缺血坏死区提供营养，进而促进骨再生。该研究对于早期ONFH的治疗有重要意义，而临床治疗却未达到我们所理想的效果，这或许是体内存在某些抑制坏死区再血管化的物质而导致血管生成效率低，因此仍需进一步研究。

4 BMSCs治疗ONFH的相关实验研究

目前，多种干细胞应用于ONFH治疗研究中，如脂肪间充质干细胞，脐带干细胞和BMSCs等，其中BMSCs最为常用[17]。研究发现，体外培养条件下，脂肪间充质干细胞和BMSCs均能促进成骨细胞分化，前者促成骨分化能力更强，但体内实验证实，脂肪间充质干细胞治疗ONFH的临床效果却明显低于BMSCs，该结果的具体机制尚不明确[18]。同时，有研究表明，将直接抽取未经分离培养的BMSCs与经过分离培养的BMSCs进行ONFH治疗比较发现，两者对ONFH治疗均有效，但后者进行ONFH治疗的疗效更佳[19,20]。目前，BMSCs移植术治疗ONFH有以下2种:①髓芯减压细胞移植术(CD)：是临床治疗手段之一，操作简单、精准有效，且能联合其他材料一起输送到骨坏死区，疗效肯定[21,22]；②动脉注射法：通过股内侧回旋动脉、股外侧回旋动脉或闭孔动脉注射BMSCs，观察其对ONFH的治疗作用，该治疗无严重不良反应[23]，并能提高干细胞的生物力学支持效果，可有效作用于缺血区域,提高疗效[24]。

尽管BMSCs对于ONFH的治疗效果确切，并逐渐走出实验阶段用于临床，能明显改善运动功能障碍、缓解疼痛[25]，但BMSCs对于ONFH的治疗效果仍未达到预期的理想结果(逆转患者病情)[17]，其可能的原因：①细胞方面：细胞活性不佳；细胞流失而停留在坏死区干细胞达不到治疗量等；②坏死区微环境：就细胞方面而言，提高BMSCs的活性，降低植入后BMSCs的流失能明显提高治疗效果[8]。研究发现，利用低强度脉冲超声处理BMSCs后，在体外能获得较高细胞活力的BMSCs[26]。而这一研究并未解决细胞的流失问题，且在植入到体内前需使用胰酶消化，此对于BMSCs的活性和功能均有不同程度损坏。而基于微载体的3D细胞培养能很好地避免该问题，其作为一个具有功能的微单元增强了细胞-细胞间的相互作用，提高了细胞活性，更重要的是植入到体内能降低BMSCs的流失，因此极大提高了再生效果[8]。

就ONFH的局部微环境而言，改善局部微环境对于提高BMSCs的治疗效果有重要意义。而坏死区总体处于破骨/成骨细胞失调、缺血，且坏死区BMSCs增殖能力和干性基因表达能力明显降低，相反成脂能力却明显增强[1,7]。调节局部微环境就是要调节破骨/成骨细胞功能平衡、改善局部缺血及提高ONFH区的BMSCs功能活性。因此对于需移植的干细胞进行基因修饰能明显改善骨坏死区微环境，使其更好地促进骨再生，提高疗效。如在体内实验中，用BMP-2修饰的BMSCs，能通过调节破骨/成骨细胞的功能平衡，促进骨再生，进而修复山羊ONFH，并取得良好效果[27]；BMP-2和BFGF修饰的BMSCs可通过促进骨形成和血管生成而成功修复犬模型中的ONFH[28]；联合BMP-2和VEGF修饰BMSCs治疗ONFH的实验结果显示，BMSCs对于坏死区的血管再生和成骨再生能力明显增强[29]；且低氧预处理后的BMSCs能增强干细胞功能活性，使其增殖能力和干性基因表达增强，成脂能力降低[30]。以上研究表明，BMSCs基因修饰和处理后能明显提高其对ONFH治疗效果，这些修饰的共同点是通过修饰后的BMSCs改善ONFH区局部的微环境，提高干细胞的治疗效果。

综上所述，BMSCs治疗ONFH的研究取得较大进展，并逐渐走出实验阶段应用于临床，但临床应用过程中治疗早期ONFH并未达到理想效果；而对BMSCs进行预处理和准确选择亚群可提高ONFH的治疗效果。利用基因工程技术对BMSCs(如BMP-2和VEGF)进行修饰，亦为更有效地利用BMSCs提供了良好的尝试。然而，这些实验研究用于临床实践之前，必须做大量工作，以便证明其疗效的确切安全，使其能更好地应用于早期ONFH的治疗，并能逆转病情达到痊愈，避免患者疾病恶化，最终面临假体置换的厄运。