代谢组学技术在心脏骤停中的应用进展

周靓，唐轶珣，祝益民

湖南师范大学附属第一医院，长沙410002

心脏骤停(CA)是全球导致死亡的主要原因之一，美国每年约35万人[1]、欧洲每年35万～70万人[2]死于心脏骤停。根据Zhang等[3]的报告,国内每年因CA而死亡的人数估计达54.4万人。尽管目前心肺复苏术(CPR)的实施有所增加、复苏后治疗有所改善，但CA的病死率仍较高，院外心脏骤停(OHCA)、院内心脏骤停(IHCA)患者的总存活率分别为9.6%、17%[4]。CA患者经CPR后恢复自主循环(ROSC)，但存活者可能会出现以脑损伤、心肌功能障碍、全身缺血再灌注损伤为主要表现的心脏骤停后综合征(PCAS)[5]。因此，CA后器官损伤机制、相关病理生理过程及病因复杂，机制尚未完全阐明。代谢组学是继基因、蛋白质、转录组学之后发展起来的一种新兴的研究系统生物学的方式。代谢组学被认为是一种行之有效的系统方法来表征代谢表型，这是对于包括环境、药物、饮食方式、生活习惯、遗传、微生物等各种内在和外在参数的一个协调的生理反应的结果。CA的发生必然伴随着代谢的改变，代谢组学是从小分子代谢物及其转化途径进行分析，使人们更深层次理解CA发生机制及过程，为靶向器官功能的复苏与保护研究提供新的研究思路及方法。有研究表明，结合代谢组学分析有助于全面了解CA发病机制、早期诊断、疾病病情评估、预后及疗效评估等[6]。现对代谢组学在CA中的应用进展进行简要综述。

1 代谢组学概念及研究过程

早在1999年，由英国Nicholson教授领导的科研团队正式提出代谢组学的概念：代谢组学是研究生物体在基因修饰下或受病理生理刺激后所有动态代谢产物的一门学科[7]，研究对象主要是细胞、组织或生物体液中内源性小分子代谢产物(<1 000 Da)。代谢组学研究过程通常为生物样本采集、预处理、分离、检测及鉴定，然后进行数据分析，进一步筛选生物标志物和分析代谢途径。

代谢组学研究常用的检测标本包括血液、尿液、胆汁、脑脊液、唾液、组织、细胞培养液和提取物等[8]，这些生物样品中代谢产物的动态变化，能反映机体疾病状态或健康状态下的重要信息，在疾病诊断、微生物、植物及功能基因组等研究领域中发挥日益重要的作用[9]。代谢组学中最常见的分析技术主要包括核磁共振(NMR)、质谱(MS)、色谱、毛细管电泳、紫外线吸收、红外光谱、放射性检测、库伦分析等[10]。由于代谢组学所分析的样品种类、浓度、性质具有差异，没有一种分析手段能检测出所有种类的化合物，故应根据研究目的及样本的性质来综合应用多种技术平台。通过代谢组学分析技术产生的大量原始数据，经过一系列的预处理后，可通过多元统计方法对数据加以整合后从中获取所需的生物学信息，包括生物表型及标志物等信息。

2 代谢组学技术在CA中的应用

2.1 代谢组学技术在明确CA病因中的应用 引起CA的病因众多，包括心脏、呼吸、循环、代谢、中毒、环境等。有研究表明，CA病因不同，其病理生理机制、组织损伤、复苏后器官功能障碍和对治疗的反应有显著差异。CA发生的原因常由临床医生根据患者既往史、发病情况、临床表现、辅助检查等作出判断。然而，在无第一目击者情况下，患者突发CA，特别是在进行CPR时，明确其病因常十分困难。因此早期识别其病因以指导有效的后续治疗尤为重要。

Varvarousis等[11]通过高分辨核磁共振氢谱(1H-NMR)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)在研究窒息致心脏骤停(ACA)和心室颤动致心脏骤停(VFCA)两种不同病因的CA猪模型中发现，两者代谢指纹在骤停和复苏阶段显著不同：ACA组在窒息期和骤停期表现出明显的代谢紊乱，而VFCA组这种现象在复苏阶段发生变化。三羧酸循环、尿素循环发生了代谢紊乱，CA预后不良的生物标志物为琥珀酸的高表达。因此，琥珀酸可为OHCA患者或法医提供重要的临床信息，并有助于确定CA的病因。Locci等[12]应用高分辨1H-NMR代谢组学技术，研究CA各阶段的不同代谢特征，发现在CA期间，三磷酸腺苷(ATP)的消耗导致肌苷增加，无氧糖酵解加速使琥珀酸增加，琥珀酸和肌苷为窒息性CA的生物标志物。由于国内外关于CA病因的代谢组学研究较少，随着代谢组学技术的飞速发展，将有更多学者致力于使用代谢组学方式从病因方面深入研究CA。

2.2 代谢组学技术在CA器官损伤与保护中的应用

2.2.1 CA脑损伤与保护的代谢组学研究 CA后造成的脑损伤是其高致残率、高病死率的主要原因。大脑独特的脆弱性是由于它对缺血的耐受性有限，以及对再灌注的独特反应。CA后引起的脑损伤机制复杂，包括兴奋性毒性、钙稳态紊乱、自由基形成、病理性蛋白酶级联反应和细胞死亡信号通路激活等[13]。脑缺血、缺氧病理状态下可导致器官、组织及细胞的能量代谢、糖代谢、氨基酸代谢及脂类代谢发生紊乱，通过代谢组学分析健康状态与CA后的差异代谢物，可对CA致脑损伤进行预后评估。

大脑是葡萄糖代谢最旺盛的组织，其储备的能量代谢底物较少。因此，大脑对缺血缺氧非常敏感。Baranovicova等[14]通过NMR代谢组学技术分析大脑血液停止后的代谢组学变化，结果显示，由于缺血性损伤，糖酵解途径受到干扰，导致酮体(丙酮、乙酰乙酸和β-羟基丁酸)水平增加、糖酵解产物含量下降。这与脑氧供停止后无氧代谢增加相关。有研究显示，CA后脑组织内糖酵解和三羧酸循环代谢物减少(如1,6-二磷酸酯果糖、3-磷酸甘油酸和柠檬酸)[15]。另有研究发现，葡萄糖代谢相关物质与窒息后的氧化应激相关[16]，该研究对窒息新生儿尿液的代谢组学研究发现，尿中有机酸升高与神经发育结局显著相关，并且与氧化应激有关，有高度敏感性和特异性。其中丙二酸乙酯、3-羟基-3-戊二酸甲酯与良好的神经发育有关，而戊二酸、丙二酸甲酯、3-羟基丁酸等则与预后不良有关。在新生窒息的仔猪模型中，使用1H-NMR进行尿液的代谢组学研究发现，代谢变异与缺氧水平相关，主要是由于尿素、肌酐、丙二酸、甲基胍、羟基异丁酸的差异显著[17]。Kim等[18]在心脏骤停-体外循环(CPB)复苏大鼠模型中，通过GC-MS和LC-MS/MS检测大鼠心脏和脑组织中的非靶向代谢产物，发现在CA期间，心脏和脑组织中脂类和碳水化合物代谢产物水平有显著变化，而在进行CPB复苏后，仅在脑组织中发现糖酵解受损和溶血磷脂增加，这表明能量代谢改变和磷脂降解可能是无法成功复苏大脑的原因之一。有研究发现，乳酸和丙酮酸可作为神经功能和预后的预测指标[19]。针对CA后脑组织损伤的治疗中，被公认为有效的治疗方式是亚低温[20]，目前尚无药物干预措施为CA患者提供神经保护。Wang等[21]研究发现，二氯乙酸治疗可增强CA大鼠模型丙酮酸脱氢酶活性，促进丙酮酸进入三羧酸循环，增加ATP的生成、降低乳酸和丙酮酸水平，同时会降低脑海马和皮质中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)的表达，可改善大鼠存活率及神经功能障碍。这一研究可为新的药物改善CA患者脑神经功能缺损提供新视角。

从食物中吸收的氨基酸，在糖代谢中分解，一类用于合成辅酶A和参与三羧酸循环，然后迅速转运至大脑中储存；另外一类氨基酸则作为神经递质和神经调质，参与大脑神经信息的传递。在Hua等[22]研究中发现，CA后诱导低温减轻并延迟脑脊液中谷氨酸增加，有助于神经功能的保护。已有研究表明，通过抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的活性，减少谷氨酸信号的传导，可保护幸存的神经元免受功能性重塑，并降低行为学习缺陷[23]。Hsu等[24]研究显示，由组氨酸-色氨酸-酮戊二酸组成的氨基酸缓冲液通过维持升高缺氧诱导因子1α(HIF-1α)水平、抑制procaspase-3活化和降低烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-4(NOX4)表达，保护CA后大鼠的神经功能。

脂质作为膜、生物能原料和信号分子的基本组成部分参与机体的生命活动。而大脑是人体脂质含量最高的器官。通过对脂质的分析可发现人类健康和疾病的生物标志物。研究显示，与氨基酸库不同，大脑中的脂肪酸池保持相对正常，在CA 20 min后，亚油酸显著降低[15]。Kim等[25]发现，CA后进行CPB复苏的大鼠脑损伤与磷脂或其氧化修饰的减少无关，而溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰胆碱仅在大脑中显著增加，表明磷脂代谢受损可能与缺血性脑损伤的严重程度相关。Anthonymuthu等[26]对CA患者行血浆脑特异性心磷脂靶向脂质组学研究，筛选出心磷脂(70∶5)可作为预测脑损伤严重程度和预后的标志物。

2.2.2 CA心脏损伤与保护的代谢组学研究 CA发生后，机体处于严重的全身缺血缺氧状态，经实施CPR后，患者恢复了自主循环后出现再灌注损伤。与急性心肌梗死所致的局部心肌顿抑不同，CA后心肌功能障碍是全身循环完全停止后所致的全身性心肌顿抑的一种特殊类型[27]。有研究表明，ROSC后的心肌损伤是患者早期死亡的重要原因[28]。代谢组学技术以独特的优势能反映CA-CPR后所引起体内代谢物的动态变化，更深入探讨CA后心肌损伤病理机制，以期提高对CA患者的救治成功率。

Shibayama等[29]在离体犬CA模型中，通过GC-MS技术研究了长时间室颤致CA后早期电衰竭的代谢物改变，研究显示糖酵解代谢增强导致乳酸堆积，这是电抑制和心脏停搏的关键代谢决定因素，室颤发生后出现的能量失衡程度决定糖酵解的速率。另外，无机焦磷酸盐可防止缺血早期线粒体膜电位丢失和电衰竭，两种保护作用之间的联系可能与线粒体ATP水解速率降低和乳酸堆积相关。这项研究阐明了长时间室颤恶化致CA的病理生理学机制。

Tsai等[30]采集恢复了自主循环的IHCA患者血清样本，研究显示支链氨基酸与胰岛素抵抗有关，可能会增加冠状动脉粥样硬化性心脏病和随后心血管事件发生的风险，丙氨酸与心脏手术中的缺血再灌注损伤有关，因此支链氨基酸和丙氨酸成为潜在的预测IHCA患者预后的生物标志物。

脂肪酸是心肌的主要能量来源之一，在心肌缺血时脂肪酸代谢受到抑制，非酯化脂肪酸显著升高[31]。Kim等[25]在大鼠CA-CPB复苏模型中研究发现，无论是CA后，还是复苏成功后，心脏的总磷脂含量并无明显变化，而各组成成分发生改变，如溶血磷脂酰肌醇在CA期间显著增加，经CPB复苏后降低，但其他溶血磷脂种类无明显变化。这种独特反应表明，磷脂酰肌醇代谢对缺血和复苏所改变的细胞状况高度敏感。

2.2.3 CA肾脏损伤与保护的代谢组学研究 CA时间较长或复苏后肾脏持续的低灌注，易发生急性肾损伤，甚至迅速发展为急性肾衰竭，病死率较高。目前，临床上肾损伤惟一可靠的检测指标是血肌酐和尿量。但是，血肌酐和尿量并不是最感敏的指标，容易受多种外在因素的影响。通过代谢组学研究CA后肾脏组织代谢谱的演变规律，可为肾脏损伤寻找新的诊断、治疗方法提供研究线索。

目前，关于CA后的肾脏代谢改变文献较少。Kim等[25]研究发现，复苏后肾脏氨基酸和脂肪酸代谢物减少，而三羧酸循环代谢物显著增加。肾脏中氨基酸代谢呈现出一种失调模式，惟一不受CA影响的是谷氨酰胺、苏氨酸、丙氨酸和缬氨酸，其余的氨基酸则显著减少；复苏后显示有更多的代谢紊乱，除谷氨酸、丙氨酸和缬氨酸外，所有测定的氨基酸均显著减少。脂质代谢总体趋势：缺血期间，肾脏组织中的脂质增加，如棕榈酸和硬脂酸显著增加；复苏后血流恢复，脂质多恢复至正常水平或降低，如硬脂酸趋于正常化，而亚油酸和亚麻酸降低。糖酵解和三羧酸循环代谢物的变化如下：在CA后3-磷酸甘油酸和酮戊二酸显著升高；然而，CPB复苏后柠檬酸、酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸和草酰乙酸等显著增加。

综上所述，尽管通过代谢组学技术，可找出CA后不同器官的差异性代谢物，但诸多研究者并未深层次地研究这些代谢产物在CA后器官损伤中的致病机制，亦未能探讨不同代谢产物间是否有关联。CA后不同器官的差异代谢产物不同，有可能与检测技术、不同物种等因素有关，但更可能与器官的代谢模式相关，同一代谢物对应的器官损伤可能不一样。因此，通过代谢组学技术描绘特定器官的代谢指纹，有助于靶向器官功能的复苏与保护。患者的复苏成功首先取决于自主循环恢复，其次取决于代谢途径受损的正常化。然而，除了初级代谢改变之外，各种次级代谢改变繁杂，如何在这么多改变的代谢产物中发现关键的标志物，更具有挑战性。