艾灸对兔膝骨关节炎软骨组织中Caveolin-1/p38 MAPK信号通路蛋白表达的影响

任秀梅，张楠，邢金云，吴双

1南通大学附属医院，江苏南通226001；2南通市中医院

膝关节骨关节炎(KOA)是一种以关节软骨退化损伤、骨质增生为主要病变特点的退行性疾病，其病理改变以关节软骨变性和丢失为主。艾灸作为我国传统自然疗法，治疗KOA的临床疗效显著，且操作简便、安全，无药物、手术等治疗的不良反应或并发症。荟萃分析显示，艾灸能有效减轻KOA患者关节疼痛，缓解关节功能限制[1，2]。本课题组前期开展的艾灸治疗KOA的随机对照临床试验结果显示，艾灸可以缓解患者的疼痛、关节僵硬等临床症状，并短期内提高患者的生活质量[3，4]。一般认为，艾灸的治疗机制主要与热效应、辐射效应等有关，但其作用的具体分子机制尚不明确。近年研究结果表明，Caveolin-1/p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路激活在KOA的发生发展中具有重要作用[5～7]。2017年12月～2019年2月，我们观察了艾灸对兔KOA关节软骨组织内Caveolin-1/p38 MAPK通路蛋白表达的影响，以探讨艾灸治疗KOA的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂 健康新西兰大耳白兔40只，体质量2.5～3.0 kg，雌雄各半，由南通大学实验动物中心提供(合格证号：201829201)；实验过程遵循实验伦理学要求，尽量减少动物使用量，并最低限度减少动物的痛苦。艾条由泰州市灸疗研究所提供；木瓜蛋白酶(Worthington，USA)，p38阻断剂SB203580(APExBIO，Houston，USA)，兔抗Caveolin-1(Abcom，ab2910)、p38 MAPK(Abclonal，A5521)、p-p38 MAPK-T180/Y182一抗(Abclonal，AP0526)，小鼠抗β-actin抗体(Abclonal，AC004)、山羊抗兔通用型二抗(北京中杉公司，ZB-2301)。

1.2 动物分组与KOA模型建立 将兔按随机数字表法分为对照组、模型组、艾灸组、抑制剂组，每组各10只。除对照组外，其余三组采用关节腔注射木瓜蛋白酶的方法建立KOA模型。称取木瓜蛋白酶40 mg溶于1 mL生理盐水中，制备4%木瓜蛋白酶溶液，充分混匀后静置30 min；以0.22 μm滤膜过滤，4 ℃保存备用。造模方法：自兔外膝眼处，于右后肢膝关节腔内注射4%木瓜蛋白酶0.1 mL/kg，第1、3、5天每日注射1次，注射结束后继续归笼喂养，造模期间每日驱赶兔活动30 min，2周后获得KOA模型。

1.3 干预处理 造模成功后，艾灸组将兔固定于固定器中；于右侧膝关节内、外侧局部剪毛，参照《实验针灸学》定位兔犊鼻穴、足三里穴；点燃艾条施灸，艾条燃端距离穴位处皮肤2 cm，施灸过程中观察兔的反应；每次每穴15 min，每周5次，连续治疗3周。抑制剂组关节腔内注射p38 MAPK抑制剂SB203580 0.1 mL(100 μmol/L)，每周1次，连续3周。模型组、对照组均不予治疗，单笼饲养，常规饮食，每日固定器固定30 min。

1.4 软骨组织中Caveolin-1/p38 MAPK通路蛋白检测 采用Western blotting法。治疗结束后，耳缘静脉注射空气处死各组动物。在无菌条件下，分离胫骨平台内侧关节面的完整软骨及软骨下骨组织，剪成碎块。加入RIPA强蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂)，放置冰上裂解30 min；超声匀浆，4 ℃下以12 000 r/min离心30 min；提取上清液，分装于EP管中，-80 ℃保存。BCA法蛋白定量后行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭2 h；TBST洗膜，分别加入一抗Caveolin-1(1∶500)和p38 MAPK(1∶1 000)、p-p38 MAPK(1∶1 000)及β-actin(1∶1 000)，4 ℃震荡孵育过夜；洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)后，室温孵育1 h；洗涤后ECL发光液显影，用Image J图像分析软件检测目的条带校正后的灰度值，以目的条带与内参的灰度比值表示其相对表达量，以p-p38 MAPK/p38 MAPK表示p38 MAPK蛋白活化情况。

2 结果

2.1 各组软骨组织中Caveolin-1蛋白表达比较 模型组、艾灸组、抑制剂组软骨组织中Caveolin-1蛋白分别为2.09±0.07，1.45±0.05，1.09±0.07，均高于对照组的1.00±0.11(P均<0.05)；与模型组比较，艾灸组、抑制剂组Caveolin-1蛋白表达降低(P均<0.05)；与抑制剂组比较，艾灸组Caveolin-1蛋白表达增加(P<0.05)。

2.2 各组软骨组织中p38 MAPK蛋白活性比较 模型组、艾灸组、抑制剂组p38 MAPK蛋白活性分别为3.25±0.08、2.52±0.17、2.07±0.14，均高于对照组的1.00±0.05(P均<0.05)；与模型组比较，艾灸组、抑制剂组软骨组织中p38 MAPK蛋白活性降低(P均<0.05)；与抑制剂组相比，艾灸组p38 MAPK蛋白活性增加(P<0.05)。

3 讨论

KOA是老年人常见的慢性关节疾患，其病理学特征是关节软骨面毛糙、脱落使软骨层变薄甚至消失。然而，迄今为止骨关节炎软骨破坏的确切机制尚不十分清楚。本课题组的前期研究结果显示，艾灸可降低患者血清IL-1β、COX-2、COMP水平[8]，但艾灸治疗KOA的分子机制仍不明确。

Caveolin-1是细胞膜凹陷结构的主要结构分子，广泛分布于终末分化的细胞，如脂肪细胞、内皮细胞、肌细胞等。它是许多信号分子的支架蛋白和负性调节蛋白，介导细胞内化、合成、增殖、迁移、凋亡等多种信号的转导，是细胞信号转导中心。有研究显示，骨关节炎患者及骨关节炎大鼠的关节软骨细胞中Caveolin-1蛋白表达显著增加，且Caveolin-1蛋白表达水平与软骨损害程度相关[9～11]。本研究结果也发现，与对照组比较，模型组关节软骨组织中Caveolin-1蛋白表达增加，与上述文献报道结果一致；与模型组比较，艾灸组与抑制剂组关节软骨组织中Caveolin-1蛋白表达均有所下降，虽然抑制剂组下降大于艾灸组，但结果仍能提示艾灸的治疗作用可能与降低Caveolin-1蛋白表达相关。

Caveolin-1蛋白对软骨细胞内p38 MAPK信号通路的激活具有重要作用，是p38 MAPK上游的关键信号分子[9]。Caveolin-1蛋白高表达能诱导p38 MAPK信号通路激活，并导致软骨细胞合成Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的能力减弱，从而促进软骨细胞凋亡。研究表明，p38 MAPK可调控软骨细胞增殖、生存，维持细胞外基质代谢平衡，在基质金属蛋白酶(MMP)、促炎症因子等所致骨关节炎软骨退变病理进程中具有关键作用[12]。因此，p38 MAPK信号通路有可能作为骨关节炎的治疗靶点。p38 MAPK磷酸化位点是决定激酶活性的关键结构，只有在苏氨酸(T180)和酪氨酸(Yl82)双位点同时被磷酸化时才具有全部活性，并在控制其自主磷酸化上起重要作用。研究发现，关节腔内注射p38 MAPK抑制剂SB203580，能显著降低MMP-1/13表达[13]，有效抑制其软骨细胞凋亡，减缓关节软骨的退变[14]。针灸治疗也能够降低兔KOA关节软骨组织中MMP-1/13表达[15]，抑制IL-1β、TNF-α等炎症因子释放[16]，从而延缓膝关节软骨的进一步破坏，达到治疗KOA的目的。本研究结果显示，模型组Caveolin-1蛋白表达和p38 MAPK蛋白活性均较对照组增加，艾灸组和抑制剂组Caveolin-1蛋白表达和p38 MAPK蛋白活性较模型组均下调，说明艾灸可能通过抑制Caveolin-1/p38 MAPK通路激活从而对KOA发挥治疗作用。但是，从艾灸组与抑制剂组组间比较来看，艾灸治疗兔KOA过程中除Caveolin-1/p38 MAPK通路参与外，可能还有其他分子通路的参与。

综上所述，Caveolin-1/p38 MAPK信号通路激活在兔KOA关节软骨退变破坏过程中起重要作用；艾灸可能通过抑制Caveolin-1/p38 MAPK信号通路异常激活，减少炎症因子的释放，进而延缓KOA的进展。