低氧环境下人乳腺癌细胞系MCF-7转录调节因子-1表达变化及其机制

刘颖，乔如丽，尚里，张锋军，焦扬驰，胡思畅，赵庆丽

中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院，兰州 730050

乳腺癌是女性中发病率和病死率都最高的一种恶性肿瘤，严重威胁女性身心健康[1]。癌症是多种内外因素不协调相互作用导致的结果，其中低氧微环境既可促进癌症的发展，也是癌细胞增殖过程中导致的结果之一[2]。转录调节因子(Ets)家族可编码一大类转录因子，这些转录因子共享一个高度保守由85个氨基酸组成的DNA结合域(Ets结构域)。Ets家族转录因子可调控多种参与癌症发生和进展的基因表达[3]。多项研究[4,5]证实，Ets家族成员E26转录特异性序列-1(Ets-1)在乳腺癌等恶性肿瘤中呈高表达，其可通过增强癌细胞的侵袭性、上皮间质转化(EMT)以及抗药性等特性促进癌症的发展。目前，已确定的Ets的下游目的基因包括参与癌细胞侵袭和转移的基质降解蛋白酶，如尿激酶和MMP-1、MMP-3、MMP-9等，均已在包括乳腺癌的多种癌症中反复得到验证[6～8]。在二级浸润性乳腺导管癌中，癌组织Ets表达明显高于癌旁组织。低氧微环境是乳腺癌的重要特点，低氧环境诱导Ets-1和Ets-2在MCF-7、SKBR3、BT20、BT474、MDAMB468等多种乳腺癌细胞系中呈高表达[9,10]。文献[9,11]报道，低氧环境与Ets-2在MCF-7乳腺癌细胞、多囊卵巢综合征中的表达相关联。但是目前关于Ets-1在乳腺癌组织中呈现高水平的机制尚不明确。2018年10月～2019年12月，我们观察了低氧环境下人乳腺癌细胞系MCF-7 Ets-1表达变化，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系、主要试剂及仪器 人乳腺癌细胞系MCF-7(Gibco公司)；DMEM-高糖培养基和胎牛血清(FBS)购自Life科技公司，青霉素以及链霉素(双抗)、胰蛋白酶购自Hyclone公司，RIPA裂解液购自北京索莱宝科技公司，Triton-100购自北京益利精细化学品公司，BCA蛋白定量检测试剂盒购自Sigma公司，蛋白酶体抑制剂MG132、p300和抑制剂C646均购自美国Selleck公司，ECL化学发光试剂盒购自Thermo Fisher公司。缺氧小室购自Stemcell公司，垂直电泳仪和电转仪(TRANS-BlotR SD)购自美国BIO-Rad公司，低温离心机(EPENDORF centrifuge 5417R)购自德国EPendorf公司，蛋白凝胶成像系统购自BIO-RAD公司，实时荧光定量PCR仪(RT-PCR 7500)购自美国ABI公司。

1.2 低氧环境下MCF-7细胞Ets-1蛋白检测 人乳腺癌细胞系MCF-7培养于含10%FBS以及1%双抗的DMEM培养基，常氧培养条件为37 ℃、5%CO2、20%O2。本研究用两种方法创造低氧环境，即CoCl2诱导的化学性低氧培养环境和厌氧培养箱物理性低氧培养环境。①CoCl2诱导的化学性低氧培养环境：取常氧培养条件下生长良好的对数期MCF-7细胞，分成4组，同时分别放入用0、100、200、400 μmol/L的氯化钴(CoCl2)化学诱导的低氧环境中培养24 h(分别计为0、100、200、400 μmol/L CoCl2组)。采用Western blot法检测Ets-1蛋白：取生长密度至80%左右MCF-7细胞，用胰酶消化各组细胞，PBS清洗两遍。使用200 μL的RIPA裂解液提取蛋白，冰上裂解30 min。使用4 ℃离心机，以13 000 r/min离心15 min，小心收集上清。使用BCA法测量蛋白浓度。根据目的蛋白分子量大小配制适宜浓度的SDS-PAGE7.5%分离胶。浓缩胶中以80 V电压，分离胶中以120 V电压进行电泳；使用PVDF膜并预活化30 min，0.3A转膜2.5 h，不同分子量大小的大白适当缩短或延长转膜时间；室温下，根据抗体说明书，用5%的脱脂牛奶或5%BSA封闭1 h；加入一抗(各抗体使用浓度见表1)4 ℃孵育过夜；次日，在摇床上使用TBST洗涤10 min，3次；加入相应二抗，室温孵育1 h；再次使用TBST洗涤10 min，3次；采用lab image软件分析各组蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH蛋白灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。②厌氧培养箱给予的低氧培养环境：取生长良好的对数期MCF-7细胞，将细胞分别置于缺氧小室和常氧小室(分别计为缺氧1组和常氧1组)，维持在37 ℃、5%CO2、1%O2或20%O2、94%N2的培养条件，培养24 h。后采用Western blot法检测Ets-1蛋白，具体步骤参照“①”。所有细胞在培养过程中，每48 h根据细胞生长状况更换一次培养基。

1.3 低氧和常氧环境下MCF-7细胞Ets-1 mRNA检测 采用荧光定量PCR(q-PCR)检测。取正常条件下培养的对数期MCF-7细胞，分别放入1%O2和20%O2的环境中培养(分别计为缺氧2组和常氧2组)，其他条件都相同并适合细胞的生长。培养24 h后用TRIzol法分别提取细胞总RNA。使用5×All-In-One RT MaterMix(APlied Biological Materials)反转录合成cDNA，cDNA可储存于-20 ℃，或直接进行后续实验。使用SYBRGreen实时定量PCR试剂盒(Thermo Scientific)完成定量PCR反应，每个反应设置三个副孔。q-PCR以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT表示目的基因的相对表达量，实验重复3次，取平均值。

1.4 低氧和常氧环境下MCF-7细胞过表达或敲降HIF-1α基因后Ets-1蛋白检测 取对数生长期MCF-7细胞，以每孔2×105个接种于两块6孔板中，放置于5%CO2、37 ℃恒温箱中培养，待细胞密度接近60%时分为两组，正常氧气量培养组在20%O2正常氧气量环境下培养，低氧气量培养组在1%O2低氧气量环境下培养。正常氧气量培养组又分为3组，转染His-HIF-1α过表达组转染过表达His-HIF-1α，蛋白酶抑制剂MG132组加入蛋白酶抑制剂MG132，对照组不予处理；低氧气量培养组又分为3组，转染HIF-1α-siRNA敲降组转染HIF-1α-siRNA，p300抑制剂C646组加入p300抑制剂，对照组不予处理。其中转染His-HIF-1α过表达组和转染HIF-1α-siRNA空载组均采用慢病毒转染，转染48 h后更换新鲜培养基，以上两组均加入2 μg/mL的puro，筛选具有抗性的细胞。取上面6组中的细胞，采用Western blot法检测Ets-1蛋白，从总体上了解过表达或敲降HIF-1α基因及加入相关抑制剂MG132和C646对Ets-1蛋白表达的影响，初步探索影响Ets-1的机制。方法参照 “1.2的①”。

1.5 低氧和常氧环境下MCF-7细胞Ace-K、p300、COP-1、His-tag、p-S/T蛋白检测 ①COP-1蛋白：取正常条件下培养的MCF-7细胞，分两组，分别放入低氧(1%O2)和常氧(20%O2)的环境中培养。用IgG做阴性对照。培养24 h后去除培养基，采用预冷的PBS清洗两遍并收集细胞。在收集的细胞中加入IP buffer[50 mmol/L Tris，1%Triton X-100，10%(v/v)甘油，150 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2，1%蛋白酶抑制剂，10 mmol/L EDTA，pH 7.5]，冰上裂解30 min。4 ℃，以13 000 r/min速度离心10 min，收集上清，加入适量免疫磁珠和相应的IP抗体(处理组：Ets-1抗体和E3泛素连接酶COP-1抗体)或等量同种IgG抗体(阴性对照)，4 ℃翻转孵育过夜。次日，将抗体-抗原-磁珠复合物进行磁性分离，使用Wash buffer(50 mmol/L Tris，1%Triton X-100，150 mmol/L NaCl)洗涤3次，加入适量上样缓冲，液煮沸5 min，收集样品，-80 ℃ 保存或直接进行后续研究。用Western blot检测蛋白共沉淀情况。②Ace-K蛋白：Ace-K蛋白是乙酰化的重要蛋白，检测Ace-K蛋白与Ets-1蛋白的共沉淀作用能证明Ets-1是否发生乙酰化。取正常条件下培养的MCF-7细胞，分两组，分别放入低氧(1%O2)和常氧(20%O2)环境中培养。用IgG做阴性对照。具体步骤参照“1.5的①”。③p300蛋白和p-S/T蛋白：取在低氧(1%O2)条件下培养的MCF-7细胞，用转染Vector并用IgG做试验的阴性对照，试验分为两组，一组为转染His-HIF-1α过表达序列和脂质体LipofectamineTM3000，一组为转入Vector阴性对照序列和脂质体LipofectamineTM3000的阴性对照组。用组氨酸标签(His-tag)做为纯化标记，采用“1.5的①”共沉淀试验检测以上3组的p-300蛋白。④COP-1、Ets-1蛋白：取低氧(1%O2)条件下培养的MCF-7细胞，加入DMSO并用IgG做试验的阴性对照，试验分为两组，一组加入DMSO做阴性对照，一组加入用DMSO配置的C646溶液，培养24 h后进行IP试验。具体步骤参照“1.5的①”。

1.6 低氧环境下MCF-7细胞Ets-1、p-300蛋白检测 采用细胞免疫荧光染色检测。取低氧环境下培养了24 h的MCF-7细胞，用胰蛋白酶消化细胞并制备单细胞悬液，密度为5×104/mL，将无菌爬片放置于24孔板中，加入细胞悬液。细胞贴壁后进行免疫荧光染色。首先使用干净预冷的PBS洗3次，加入4%的多聚甲醛室温固定20min，然后置于摇床上用PBS清洗3次，每次3 min。滴加0.3%Triton穿孔处理20 min，再次用PBS清洗3次。1%BSA封闭1h后，滴加一抗，孵育过夜。次日，用PBS清洗3次，加二抗，室温孵育1h，注意避光。然后，PBS清洗3次，用DAPI染色5 min，PBS彻底清洗3次，10 min/次。最后，用防荧光猝灭剂封片。干燥，避光4 ℃保存。待玻片干燥，在荧光显微镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 低氧环境下MCF-7细胞Ets-1蛋白相对表达量比较 0、100、200、400 μmol/L CoCl2组Ets-1蛋白相对表达量分别是0.87、1.15、1.43、1.62，后3组与第1组比较，P均<0.05。常氧1组和缺氧1组Ets-1蛋白相对表达量分别是0.11、0.74，两组比较，P<0.05。

2.2 低氧和常氧环境下MCF-7细胞Ets-1 mRNA相对表达量比较 低氧2组及常氧2组Ets-1 mRNA相对表达量分别为0.002 7、0.001 8，两组比较，P<0.05。

2.3 低氧和常氧环境下MCF-7细胞过表达或敲降HIF-1α基因后Ets-1蛋白相对表达量比较 常氧条件下，对照组、转染His-HIF-1α过表达HIF-1α组、加入MG132组的Ets-1蛋白相对表达量分别是0.14、0.81和0.84，过表达HIF-1α组、加入MG132组分别与对照组比较，P均<0.05。在低氧环境下，对照组、siRNA敲降HIF-1α组、加入C646组的Ets-1蛋白相对表达量分别为0.86、0.83、0.86，两两比较，P均>0.05。

2.4 低氧和常氧环境下MCF-7细胞Ace-K、p300、COP-1、His-tag、p-S/T蛋白相对表达量比较 ①Co-IP试验检测了常氧条件(20%O2)和低氧环境(1%O2)刺激下，Ets-1与E3泛素连接酶COP-1的相互作用，结果显示低氧环境干扰了Ets-1的降解途径，Ets-1与COP-1存在共沉淀现象，并且低氧环境影响了共沉淀情况。②乙酰化分析结果显示，低氧引起的Ets-1乙酰化水平升高并干扰Ets-1的泛素化修饰。低氧刺激(1%O2)下MCF-7细胞Ets-1乙酰化水平高于常氧(20%O2)条件下的Ets-1。常氧组和低氧组都发生了Ets-1与Ace-K共沉淀的现象，20%O2组的Ets-1的表达水平相较于1%O2组有明显升高。乙酰化的Ets-1蛋白泛素化降解可能受到竞争性抑制，进而影响低氧环境下Ets-1的表达水平。③低氧环境通过p300增强乳腺癌细胞中Ets-1的乙酰化水平。过表达HIF-1α时，乙酰基转移酶p300蛋白水平相对于vector阴性对照组无显著改变，但其磷酸化水平显著升高，p-S/T的表达水平相对于vector组显著升高，提示了乙酰基转移酶活性增强。④使用p300抑制剂C646处理生存于低氧环境的MCF-7细胞，Ets-1蛋白表达相较于DMSO对照组无明显变化，但Ets-1与COP-1互作相对加强，共沉淀效果加强，说明二者相互作用增强依赖于p300活性的减弱。而C646作用后的MCF-7细胞中Ets-1的表达水平相对于DMSO对照组显著降低。因此，低氧环境通过活化的P300蛋白调节Ets-1的乙酰化的水平影响Ets-1的泛素化降解。

2.5 低氧环境下MCF-7细胞Ets-1、p-300蛋白免疫荧光染色结果 低氧环境(1%O2)下p300蛋白和Ets-1蛋白在MCF-7细胞质中发生了共表达和共定位。

3 讨论

乳腺癌严重威胁女性健康，以每年17 000 000新发病例的速度在增长[12,13]。近年来，虽然乳腺癌患者可以选择多种新的治疗方案，但伴有肿瘤细胞转移的患者平均生存率仅为2 %。有研究预测发展中国家未来20年内乳腺癌发病率和病死率将增加55%、58%[14]。低氧环境是肿瘤的重要特征，25%～40%的侵袭性乳腺癌展现出低氧区域。采用polarographic electrodes策略检测发现，正常乳腺组织平均氧分压为(14.1±0.3) mmHg，而肿瘤组织中氧分压仅为(10.3±0.4) mmHg[15,16]。研究[9,10]表明，Ets转录因子在乳腺癌细胞系中高表达，且与乳腺癌的侵袭和转移密切相关。但是，Ets在乳腺癌中的高表达的机制及与低氧微环境的关系尚不清楚。

Ets转录因子超家族是细胞内最重要的转录调节因子之一，其受多种细胞外刺激和信号通路的调节，如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)。在胚胎发育过程中，MAPK通过招募共激活因子CREB和p300磷酸化Ets-1、Ets-2，该过程在正常发育和肿瘤发生等生理过程中发挥重要作用[17]。研究[18]表明，在多种恶性肿瘤的进展过程中，Ets家族蛋白异常高表达，提示该家族转录因子在癌症发展中起重要作用。同时癌细胞增殖过程中，随着细胞的增多，营养物质相对减少，氧消耗量也显著增多，造成缺氧的肿瘤微环境，癌细胞可通过激活相关的信号通路，促进癌基因表达，发展出适应低氧微环境的机制。研究[18]发现，HIF可促进肿瘤血管内皮生长因子 (VEGF)和促红细胞生成素基因的表达。在肿瘤发展进程中，除了经典的目的基因之外，Ets-1也可通过调控VEGF受体和血管生成素2的表达而促进癌组织中血管的生成[19,20]。HIF与Ets-1之间可能存在相互调控关系。Oikawa等在膀胱癌T24细胞系中研究发现，位于Ets-1启动子上游-424到-279 bp序列为低氧应答元件样序列(HRE)，在低氧环境下，HIF-1α可以与之结合并促进Ets-1的表达[21]。以上研究结果提示我们，Ets-1的表达水平有可能受HIF-1α调控。而且，HIF-1α是低氧环境下重要的细胞因子，其在乳腺癌组织中表达水平明显高于癌旁组织，暗示低氧环境HIF-1α可能调节乳腺癌细胞中Ets-1的高表达。

本研究旨在探究乳腺癌细胞系中低氧微环境调节Ets-1高表达的分子机制。通过q-PCR实验，我们证实了在乳腺癌细胞中低氧刺激可促进Ets-1 mRNA水平的表达，即低氧环境增加了Ets-1蛋白的来源。这与Oikawa等在膀胱癌细胞系中的研究结果一致。为了尽可能全面的阐释低氧微环境导致Ets-1蛋白在乳腺癌细胞系中升高的机制，我们从Ets-1蛋白降解的角度进行了研究。Ets-1蛋白经泛素-蛋白酶体途径降解。Ets-1可在赖氨酸(Lysine,K)位点上接受多修饰系统直接被调控，如小泛素样修饰(SUMO)系统，COP-1介导的K-48多聚泛素链修饰，以及乙酰化修饰等。而且，不同的翻译后修饰相互竞争，形成一种高效且可逆的调节方式，无需冗杂的蛋白从头合成，使细胞能够对外界环境作出迅速灵敏的反应[22]。SUMO修饰往往不改变Ets-1蛋白稳定性，更多是在其转录活性方面起调节作用[12]。因此我们推断，低氧刺激下，Ets-1乙酰化水平升高，阻碍了COP-1的识别，进而导致蛋白在细胞质积聚。乙酰化分析验证了这一推断，在低氧培养条件下，Ets-1乙酰化水平显著升高，并且Ets-1与COP-1互作也被削弱。

p300是真核生物中最重要的乙酰基转移酶之一，其活性接受磷酸化/去磷酸化调控[15]。之前研究表明，过表达HIF-1α后，p300磷酸化水平显著升高。但对HIF-1α调控p300磷酸化的机制，尚未进行深入的探索。有文章报道，低氧环境下，MAPK等信号通路异常活化，ERK/MAPK可使p300磷酸化，酶活性增强，我们推测这可能是有效的分子机制之一。但是，由于p300蛋白分子量偏大，多次Co-IP实验结果均不理想，因此我们使用细胞免疫荧光染色的方法较直观得提供了二者在空间上可能互作的信息，但依然缺乏更为精确的证据。随后，我们使用p300抑制剂C646处理培养于低氧环境中的MCF-7乳腺癌细胞，Ets-1蛋白水平降低，并且Ets-1和COP-1的相互作用显著增强，这也进一步证实了p300在Ets-1稳定性调节中的重要性。

总之，低氧环境在乳腺癌细胞系中促进Ets-1的转录并促进其泛素化降解；机制可能是低氧环境中的HIF-1α引起乙酰基转移酶p300活性增强，促进Ets-1发生乙酰化，这阻碍了COP-1对Ets-1的识别及后续的泛素化降解，造成Ets-1细胞内水平增加。