电针预处理对MCAO大鼠脑保护机制的研究进展

程爱芳，张英杰，陶苗苗，徐鸣曙

(1.上海中医药大学，上海 201203;2.上海市针灸经络研究所，上海 200030)

卒中目前在我国处于高发态势，其中缺血性卒中占全部卒中的70%左右[1]。缺血性卒中发生后患者不同程度地丧失其劳动及生活自理能力，给家庭和社会带来巨大负担。目前，对于缺血性卒中的预防更多地处于基础研究阶段，主要研究对象基于大脑中动脉阻塞模型(middle cerebral artery occlusion， MCAO)大鼠，主要预处理方式包括针刺预处理、药物预处理、高压氧预处理、远隔缺血预处理等，研究表明预处理方式可在一定程度上诱导脑缺血耐受[2-4]。

电针疗法作为绿色疗法的一部分，被越来越多地应用和研究[5]。有报道显示，电针预处理大鼠“百会”可使大鼠脑缺血后神经功能减退得到改善，脑梗死面积减小，并提出“电针预处理”的概念[6]。此后，有关电针预处理的报道不断出现[7-8]。然而，对于电针预处理的脑保护机制仍不甚明确，本研究希望通过归纳现有文献中有关电针预处理脑保护机制的研究，为今后电针预处理的临床应用提供科学依据，现报道如下。

1 减轻炎症反应

对于机体而言，适度的炎症反应可以杀菌、清除和修复损伤组织，而过度的炎症反应则会加重患区的溃烂及功能衰减甚至丧失。有研究显示，在 MCAO术后，再灌注损伤导致炎症反应发生，过度的炎症反应致使伤口难以愈合，并且加重了实验中动物梗死的发生及神经功能缺陷，而炎症反应又进一步加重了脑缺血再灌注损伤[9]。脑缺血后，白细胞、小胶质细胞被激活并释放大量的细胞因子，这些物质在脑缺血再灌注损伤的过程中发挥了重要作用[10]。

1.1 白细胞及相关细胞因子

急性脑缺血后，早期免疫系统迅速启动，免疫细胞激活，参与炎症反应。白细胞是人体最主要的免疫细胞，肿 瘤 坏 死 因 子 -α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)是缺血再灌注损伤后较早表达的炎症细胞因子。脑缺血再灌注急性期白细胞被 IL-1β、TNF-α等炎性因子激活，之后在细胞黏附分子作用下黏附于缺血区微血管内皮细胞上，阻塞微血管，使再灌注血流减少;并且随着再灌注的发生，在趋化因子白介素-8(IL-8)的作用下，白细胞进入缺血区，释放促炎因子，加重炎症反应。可见，减少白细胞浸润，抑制 IL-8、IL-1β、TNF-α等因子的产生和释放对脑组织损伤能够起到保护作用[9]。电针预处理能够下调脑缺血再灌注大鼠血浆中的 IL-6、IL-1β及 TNF-α含量，从上游阻断炎症反应的恶性循环，减轻神经功能损伤，实现脑保护作用[11]。同时，电针预处理还可能通过调控嘌呤受体P2Y1R、P2X7R的表达，减少炎性因子TNF-α、IL-β含量，诱导脑缺血耐受[12]。

1.2 小胶质细胞及相关细胞因子

在中枢神经系统中，小胶质细胞发挥着类巨噬细胞的作用，是最先针对损伤产生应答的细胞，是中枢神经系统第一道免疫防线。活化的小胶质细胞分为经典激活状态(M1型)和选择性激活状态(M2型)两种表型[13]。前者受 Toll样受体 4(toll-like receptor4，TLR-4)和干扰素-γ (interferon-γ， IFN-γ)激活，可增加促炎因子的产生，加重炎症反应和组织损伤程度。后者主要由白介素-4(IL-4)或白介素-13(IL-13)诱导，通过发挥巨噬细胞的作用达到抑制过度炎症反应和修复组织损伤的效果。脑缺血损伤发生后，小胶质细胞聚集在病灶周边，发挥双重调节作用。一方面，小胶质细胞不停地吞噬及清除病原体、细胞碎片等毒性物质充分发挥抗神经损伤作用[14]。与此同时，小胶质细胞过度活化产生多种过量的炎性介质，加重神经损害过程[15]。电针预处理可减少 MCAO大鼠脑内 TRL4、NF-κB蛋白表达，抑制小胶质细胞 TRL4/NF-κB信号通路的活性，减轻炎性反应，减轻MCAO大鼠神经损伤[16]。电针预处理能够调控小胶质细胞活化状态，在脑缺血再灌注损伤修复期，诱导小胶质细胞由M1型向M2型转化，进而发挥抗炎作用，达到脑保护的目的[17]。

2 抑制兴奋性氨基酸毒性

兴奋性氨基酸的兴奋性毒性被认为是脑缺血损伤级联反应诱发的初始因素[18]。广泛分布于神经系统的谷氨酸是中枢神经系统内主要的兴奋性氨基酸神经递质，正常状态下，谷氨酸由突触前膜释放到突触间隙，作用于突触后膜上的受体，以完成一系列生理性活动。在突触间隙中，谷氨酸的清除(再摄取)主要依赖谷氨酸转运体(glutamate transporter-1， GLT-1)[19]。脑缺血状态下谷氨酸转运体功能紊乱，谷氨酸过度蓄积并刺激谷氨酸受体过度兴奋，进而过度刺激神经元，诱发神经元兴奋性损伤[20]。因此，脑缺血后，减轻氨基酸兴奋性损伤可以从其转运体及受体两方面考虑。

2.1 调节谷氨酸受体

突触(细胞)膜上谷氨酸受体主要有代谢型受体(metabotropic glutamate recrptors， mGluRs)和离子型受体 N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor， NMDA)受体与α-氨基-3-羟基-5-甲基-异恶唑丙酸 (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid recrptor， AMPA)受体[21]。NMDA受体主要由NR1、NR2、NR3 3种亚基组成。当NMDA受体被Glu激活后，会使细胞膜的通透性增加，主要是增加细胞内的钙离子(Ca2+)水平，从而加剧Glu兴奋性毒性作用。AMPA的亚基受体GluR2可以限制细胞膜对Ca2+及其他阳离子的通透作用。脑缺血再灌注后，GluR2减少，形成以GluR1或GluR3为主、GluR2缺乏的新受体，使细胞内Ca2+水平增加，加重脑损伤[22]。研究显示，电针能抑制大鼠缺血脑组织 mGluRs的表达，缓解脑损伤[23]。电针预处理可使缺血脑区NR1的表达水平显著降低，发挥神经保护作用[24]。同时，电针预处理也通过调节大麻素受体1(cannabinoid receptor 1，CB1R)提高GluR2表达水平，以抑制突触后膜对Ca2+的通透作用，减轻兴奋性毒性，改善神经功能[25]。

2.2 调节谷氨酸转运体

谷氨酸再摄取最主要细胞类型是星型胶质细胞[26]。在大鼠星型胶质细胞内表达的主要谷氨酸转运体是 GLT-1，其对应的人类同源体是兴奋性氨基酸转运 体 2(excitatory amino acid transporter 2，EAAT2)。有研究显示，电针可以提高脑内谷氨酸转运体GLT-1的表达和活性[27]，也可使缺血半暗带的EAAT2下调水平被抑制[28]，缺血区细胞外谷氨酸浓度下降[29]，以减轻脑缺血后神经细胞损伤，诱导脑缺血耐受。

3 减少细胞凋亡与自噬

机体内细胞程序性死亡的两种主要形式是细胞凋亡和细胞自噬。细胞凋亡是一种主动过程，涉及到一系列基因的激活、表达以及调控等程序。细胞自噬是细胞自身溶酶体降解细胞内自身物质，尤其是长寿蛋白和受损细胞器的过程。生理情况下，细胞凋亡和细胞自噬共同维持细胞内环境稳态。

3.1 减少神经细胞凋亡

缺血性脑损伤与神经细胞凋亡关系密切。脑缺血后，由于急骤缺血缺氧，缺血中心区的神经细胞发生不可逆的损伤，迅速死亡。而在缺血半暗带区，神经细胞损伤具有可逆性，若损伤未能得到及时修复，则会导致缺血半暗带的神经细胞凋亡。因此抑制脑缺血后神经细胞凋亡的发生，是发挥脑神经保护机制的关键环节。细胞凋亡是由特定的基因和蛋白调控的[30]。其中细胞凋亡蛋白酶(caspase)家族中的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)是缺血半暗带区介导细胞凋亡至关重要的蛋白酶[31]。组织缺氧等应激变化，可诱导p53蛋白激活，而被激活的p53蛋白能够调节细胞周期，调控细胞分化和促进细胞凋亡[32]。另外，抗凋亡基因(Bcl-2)与促凋亡基因(Bax)亦相互作用来影响脑缺血再灌注损伤的细胞凋亡[33]。研究显示，电针预处理能够抑制脑缺血后缺血半暗带皮质区域caspase-3、p53及Bax表达上调，促进Bcl-2表达上调减少缺血后细胞凋亡[34]。

3.2 调节细胞自噬

脑缺血后，细胞自噬在缺血脑组织内发挥“双刃剑”作用。一方面自噬适度激活可保护神经细胞，发挥脑保护作用。另一方面，过度激活自噬可导致自噬细胞的裂解、死亡。另外自噬不足，受损的细胞器和蛋白不能及时被清除，也会影响细胞的功能，加重脑损伤[35]。已有研究证实电针可通过调节自噬相关蛋白 LC3A/B适度激活自噬，进而改善神经功能[36]。电针预处理能够抑制AMPK-Beclin1/Vps34通路以减少自噬激活[37]。

4 抗氧化应激

氧化应激因体内的活性氧、氧自由基增加，以及抗氧化应激防御系统的减少而发生。氧化应激能够激活细胞内的凋亡信号通路，导致细胞死亡。线粒体是细胞的“能量工厂”，参与氧化应激反应。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)是一种抗氧化剂，可清除体内氧自由基，丙二醛(malondialdehyde， MDA)是自由基作用于脂质发生过氧化反应的最终产物，两者是反应氧化应激程度的重要指标。脑缺血再灌注后缺血组织会产生大量活性氧和自由基，引发线粒体功能障碍，导致脑组织内氧化与抗氧化系统失衡，造成脑损伤。有研究显示，电针预处理可减轻MCAO大鼠脑组织中线粒体结构损伤，同时上调 SOD水平，下调 MDA水平[38]，实现对缺血组织神经元的保护作用。

5 维持血脑屏障完整性

血脑屏障(blood-brain barrier， BBB)由连接紧密的毛细血管内皮细胞、完整的基底膜以及星形胶质细胞终足共同组成的神经胶质膜结构[39]，作为一种弥散屏障用于维持中枢系统功能。脑缺血后，BBB完整性被破坏，导致脑水肿，引起神经细胞的损伤及凋亡[40]。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)是基质金属蛋白酶家族中与脑微血管疾病关系最为密切的酶[41]，在缺血后血脑屏障损伤和血管源性脑水肿的发生中起关键作用[42]。电针预处理后，MCAO大鼠缺血脑组织中 MMP-9的表达及活性明显降低[43]，脑水肿症状减轻[44]，可见，电针预处理能够通过降低MMP-9的表达以维持血脑屏障完整性。

6 讨论

综上所述，电针预处理能够调节白细胞和小胶质细胞及相关细胞因子以减轻神经元的炎性反应，并通过抑制兴奋性氨基酸毒性来减少神经元变性;电针预处理还通过平衡脑组织内氧化与抗氧化系统、调控神经细胞凋亡和自噬相关蛋白及通路，从而降低神经元的大面积死亡程度;电针预处理通过维持血脑屏障完整性，以及抑制再灌注后血管源性脑水肿的发生和出血性转化来实现缺血性卒中的脑保护效应，电针预处理具有显著的诱导脑缺血耐受效应[5，10，14，29，38]。电针预处理诱导脑缺血耐受的过程，是通过调控机体内多种途径的各类分子、不同细胞、相关蛋白，进而调节脑血流、脑代谢、神经血管活动得以实现的，电针预处理是具有多水平、多靶点、多途径特色的一种干预手段。

当前的实验研究多选择 MCAO大鼠缺血侧脑组织进行研究，对于健侧脑相关区域的研究较少。缺血性脑损伤患者不仅存在病灶本身的变化，也存在一系列继发性改变，包括缺血半暗带区域以及健侧大脑半球。有研究报道，脑缺血急性期时健侧大脑半球激发者预后更佳[45]，且锻炼健侧的康复方法在临床上也较有成效[46]。在今后的研究中，可以考虑以健侧为目的区域，科学全面地观察电针预处理对脑缺血耐受作用。现有关电针诱导脑缺血耐受的研究，实验方案不统一，针刺方法种类多样、穴位选择标准不一、干预时机未能明确。在未来的研究中，进一步优化实验方案，确定针对性的针刺方法(如不同年龄的MCAO大鼠采用不同的针刺方式)，选择循证医学支持下较为统一的穴位配伍方式(如五腧穴、经穴、阿是穴)，明确干预周期及干预时间，以期获得更大、更稳定的研究价值。目前对于电针预处理诱导脑缺血耐受的机制研究中，在实验的时效方面，未能及时监测干预时相关脑区的即时活动状态，即电生理技术的使用尚欠充分。近年来，功能性磁共振成像作为一种对机体无损的技术，已被广泛应用于视觉、思维、情感、认知等方面的研究[47]。小动物磁共振的使用日益广泛，光遗传技术的应用和成熟也为电针预处理卒中研究带来了新的技术方案。在今后的实验中，可以考虑利用先进技术进行针灸脑科学领域的应用与研究，以明确脑功能区对电针预处理的反应，即时观察针刺的神经机制，从而促进针灸与现代医学融合。另外，目前电针预处理诱导脑缺血耐受的方式在临床上应用范围较局限，之后可尝试单独或配合其他预处理方式对冠心病、高血压等具有卒中危险因素的对象进行临床干预，以扩大电针预处理的临床适用范围。