电针和CO2激光灸对奥沙利铂所致周围神经毒性大鼠的外周保护机制

施舍，范神栋，王凤娇，张雪慧，王珂，具紫勇

(1.上海中医药大学，上海 201203;2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437)

奥沙利铂(oxaliplatin， OXA)作为第三代铂类抗肿瘤药物，具有高效性、低毒性和安全性，广泛应用于结直肠癌、胰腺癌和胃癌的治疗[1]。然而，奥沙利铂往往会引起周围神经病变，主要包括感觉异常，例如机械性异常性疼痛或冷异常性肢体感觉异常[2]。作为最主要的剂量限制性毒性，奥沙利铂诱导的周围神经病变(oxaliplatin-induced peripheral neuropathy，OIPN)严重影响了癌症患者的生存质量[3]。目前尚无确定的治疗策略可预防这些不良反应[4]。临床研究表明，无论是针刺治疗还是艾灸治疗均能缓解奥沙利铂所致的周围神经毒性[5-6]，但两者之间是否具有相似的效应和机制尚不明确。电针是在传统手针基础上发展起来，其刺激参数具有良好的可控性[7]。同样，CO2激光灸是在传统艾灸的基础上发展而来的一种光灸刺激方法，能较好地模拟传统隔物灸的效应发挥治疗作用，同时具有较好的可重复性[8-10]。因此，为了探讨电针和 CO2激光灸治疗OIPN的可能机制，笔者进行了本项研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

成年健康清洁级雄性 SD大鼠 40只，体质量(200±20)g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供[SCXK(沪)2013-0016]，饲养于上海中医药大学动物实验中心。自由进食饮水，每日光照 12 h。动物实验伦理委员会批准编号为201710002。用SPSS21.0软件产生随机化分组方案。随机取10只大鼠作为对照组;其余30只造模成功的大鼠随机分为模型组、电针组、和CO2激光灸组，每组10只。

1.2 主要试剂与仪器

奥沙利铂(南京制药厂有限公司，批号H20000686);兔抗瞬态电压感受电位锚定蛋白 1(transient receptor potential ankyrin 1， TRPA1)多克隆抗体(Thermo Fisher);鼠抗神经生长因子(nerve growth factor， NGF)单克隆抗体(Santa Cruz);羊抗兔、羊抗鼠二抗(上海威奥生物科技有限公司);Von-Frey纤维丝(DanMic Global，美国LLC公司);冷热板测痛仪(YLS-21A，济南益延科技发展有限公司);针灸毫针(GB2024-94，苏州医疗用品厂有限公司);韩氏穴位神经刺激仪(HANS-200E，南京济生医疗科技有限公司);CO2激光灸疗仪(SX10-C1，上海万奇光电技术有限公司);透射电子显微镜(JEM-1230，日本电子株式会社广州事务所)。

1.3 模型制备

将奥沙利铂溶液充分溶解于 5%的葡萄糖溶液，浓度为 1 mg/mL;除空白组外，其余大鼠每隔 1 d以2 mg/kg剂量给予共4次腹腔注射(第1天，第3天，第5天和第7天)，建立OIPN模型[11]，对照组采用相同的造模方法用等体积的5%葡萄糖溶液进行腹腔注射。

1.4 干预方法

大鼠最后一次奥沙利铂注射后，第2天开始治疗，隔日 1次，共 7次。电针组取双侧足三里穴，使用0.25 mm×13 mm毫针直刺大鼠膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处，深度7 mm，针刺完毕后，针灸针与韩氏电针仪相连，频率为2 Hz，电流强度为1 mA，选连续波，每穴每次30 min。CO2激光灸组使用CO2激光灸疗仪灸双侧足三里穴，功率80 mV，每穴每次15 min。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 大鼠机械性痛觉敏化测试

各组大鼠于造模前、造模后、电针和 CO2激光灸第4次和第7次治疗后进行机械性痛觉敏化测试。将各组大鼠分别放于测试架的金属网上，测试前将大鼠放于金属网上 15 min。参考之前的报道[12-13]，采用“up-down”的方法测定大鼠 50%缩足阈值(paw withdrawal threshold， PWT)。采用 1 g、4 g、10 g、15 g、26 g、60 g的Von-Frey纤维丝进行刺激，以纤维丝呈现“S”形为度，每次持续5 s，大鼠的每侧足底分别测量 6次，每一次测量需要和上一次测量时间间隔6 s以上，大鼠在刺激时间内或在移开纤维丝时所立即出现的快速的抬足反应记为阳性反应。

1.5.2 大鼠冷刺激敏感度测试

各组大鼠于造模前、造模后、电针和 CO2激光灸第4次和第7次治疗后进行测试。打开冷热板测痛仪，将温度设定在 4℃，待板上温度恒定并达到设定温度时，将大鼠置于冷板上，记录5 min内大鼠抬足或舔足的次数，连续测定3次，取平均值为最后结果[14]。

1.5.3 大鼠坐骨神经电镜下组织形态学观察

于最后一次痛阈测试结束后，各组大鼠腹腔注射深度麻醉，俯卧位固定，钝性分离坐骨神经2 cm左右。将用于Western blot检测的坐骨神经用锡箔纸包裹迅速冻于液氮中，然后转移至-80℃冰箱中保存备用。而用于透射电镜观察实验的坐骨神经则置于 4℃预冷的2.5%戊二醛缓冲液中固定，按照说明操作进行清洗、固定、渗透等步骤，最后在透射电子显微镜下观察并拍照。

1.5.4 TRPA1、NGF蛋白表达检测

对坐骨神经组织进行蛋白上清液的制备和浓度测定。每个样本取30 μg蛋白上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，分别加入一抗 TRPA1、NGF(浓度分别为1:1000和1:1200)和GAPDH，4℃孵育过夜，加二抗孵育。超敏ECL化学发光液与膜反应2 min，然后在暗室中利用X胶片进行感光、显影和定影。

1.6 统计学方法

应用 SPSS21.0统计软件对所有数据进行统计处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，对于不同时间点的比较，采用重复测量的方差分析;对于多组间比较方法，釆用单因素方差分析，均继以LSD进行两两比较。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠PWT值比较

与对照组比较，模型组造模后各时间点 PWT值显著降低(P＜0.01)。与模型组比较，电针组治疗4次和7次后大鼠PWT值显著上调(P＜0.01)。但CO2激光灸组大鼠 PWT值与模型组比较，各时间点差异均无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠PWT值比较 (±s)

表1 各组大鼠PWT值比较 (±s)

注:与对照组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01

组别 n 造模前 造模后 第4次治疗后 第7次治疗后对照组 10 39.51±5.39 33.56±5.56 35.64±6.43 30.39±4.25模型组 10 36.23±6.32 5.04±1.771) 4.15±1.541) 2.52±1.131)电针组 10 35.82±6.17 4.67±1.841) 18.94±2.212) 19.34±2.642)CO2激光灸组 10 36.75±5.71 2.91±1.131) 3.73±1.731) 4.86±0.751)

2.2 各组大鼠冷刺激敏感度比较

与对照组比较，模型组造模后各时间点冷刺激抬足反应率显著升高(P＜0.05)。与模型组比较，电针组和CO2激光灸组在治疗4次和7次后大鼠冷刺激抬足反应率显著下调(P＜0.01)。详见表2。

表2 各组大鼠冷刺激敏感度比较 (±s)

表2 各组大鼠冷刺激敏感度比较 (±s)

注:与对照组比较1)P＜0.05，2)P＜0.01;与模型组比较3)P＜0.01

组别 n 造模前 造模后 第4次治疗后 第7次治疗后对照组 10 1.83±0.43 2.01±0.51 1.65±0.41 1.07±0.32模型组 10 1.66±0.36 8.73±2.471) 10.76±2.092) 11.32±1.562)电针组 10 1.74±0.39 7.12±2.251) 1.85±0.453) 1.81±0.443)CO2激光灸组 10 1.59±0.41 5.83±1.191) 1.47±0.363) 1.76±0.463)

2.3 各组大鼠坐骨神经电镜下组织形态学比较

对照组大鼠坐骨神经有髓神经纤维髓鞘致密均匀、结构完整，中心为突触，其外有明暗相间的同心板层髓鞘结构，其内有排列整齐的微丝、微管，无髓神经纤维正常。模型组大鼠坐骨神经有髓神经纤维髓鞘板层增厚、不均匀，排列略疏松紊乱，结构分层变性溶解，偶见断裂缺损，可见脱髓鞘，部分轴突有萎缩和变性的改变，也可见轴浆内部分线粒体肿胀。电针组和 CO2激光灸组大鼠坐骨神经形态较模型组有一定改善。详见图1。

2.4 各组大鼠坐骨神经TRPA1和NGF蛋白表达的比较

与对照组比较，模型组大鼠坐骨神经区域 TRPA1的蛋白表达明显上调(P＜0.01)，而NGF的蛋白表达明显下调(P＜0.01)。电针或 CO2激光灸治疗后，与模型组相比，电针组和CO2激光灸组TRPA1表达均明显下调(P＜0.01)，而 NGF的表达明显上调(P＜0.01，P＜0.05)。详见图2。

图1 各组大鼠坐骨神经电镜形态

图2 各组大鼠坐骨神经TRPA1和NGF蛋白水平的比较

3 讨论

奥沙利铂诱导的周围神经病变(OIPN)临床以肢端感觉异常、刺痛、麻木、无力、遇冷诱发或加重，腱反射减退等为主要症状。在中医学中属“痹证”“血痹”范畴，其主要病机为气血两虚、瘀血阻络[15]。《素问·五脏生成》:“血凝于肤者，为痹。”汪机的《医学原理》:“有气虚不能导血荣养筋脉而作麻木者。有因血虚无以荣养筋肉。以致经隧涩而作麻木者。”沈金鳌在《杂病源流犀烛》中指出:“麻，气虚是本，风痰是标;木，死血凝滞于内，而外挟风寒，阳气虚败，不能运动。”针灸疗法可激发经络经气，达到舒筋活络、调节阴阳的作用，进而缓解或改善OIPN的损伤[16]。电针和艾灸均能改善奥沙利铂引起的神经毒性[5，17]。本研究表明电针能够有效改善大鼠奥沙利铂所致的机械痛敏，同时改善异常的冷痛觉，CO2激光灸可有效改善其冷痛敏。研究发现电针可以有效降低大鼠奥沙利铂所致痛觉过敏和超敏反应，与改善OIPN大鼠的坐骨神经传导速度密切相关[18]。本研究发现OIPN大鼠坐骨神经损伤出现髓鞘变性为主的病理改变，提示OIPN可导致外周神经的组织结构变性和损伤。经过电针和CO2激光灸干预后，坐骨神经在神经组织形态学上有一定程度的改善，表明电针和 CO2激光灸在治疗奥沙利铂所致周围神经病变中发挥着重要作用。本研究笔者采用了隔日1次进行干预的方式，主要是基于笔者前期临床和实验研究取得良好的效果[19-20]。间隔干预是一种有效的干预手段，如每周给予1～2次针刺刺激能明显改善乳腺癌患者化疗药引起的周围神经病变[21]。连续每日刺激同样能有效改善 OIPN[5，22]。但两种刺激方式是否在疗效上存在差异，有待后续的进一步临床研究。

TRPA1是一种瞬间受体电位离子通道，作为环境刺激物传感器，它可以将多种信号从外周传递至中枢，在冷觉、温觉、机械刺激以及疼痛感受中发挥重要作用[23]。雪旺细胞作为一种周围神经的胶质细胞，可为外周神经轴突提供支持，并且形成髓鞘。雪旺细胞上TRPA1的异常激活与神经病理性疼痛密切相关，沉默TRPA1可减弱异常性疼痛感知[24]。研究发现OIPN时大鼠背根神经节 TRPA1的表达增加，并认为这一改变与OIPN时的冷痛觉异常正相关[25]。本研究结果显示OIPN时大鼠坐骨神经的TRPA1表达增加，且电针和CO2激光灸均可在一定程度上下调 TRPA1表达的异常增高，与之前的报道相一致。NGF作为一种分泌型的多肽物质，在调节和维持神经元的存活、生长和分化等方面发挥重要作用[26]。本研究结果显示电针和 CO2激光灸治疗后可抑制坐骨神经 NGF表达的下调。临床研究表明，外周血中NGF的表达水平与化疗药物导致的外周神经病变呈负相关[27]。当外源性给予高剂量的NGF可以有效抵抗奥沙利铂诱导的神经元死亡[28]。最近研究发现，提高坐骨神经和背根神经节的 NGF表达是丹参酮ⅡA抑制奥沙利铂诱导的痛觉过敏和神经元凋亡[27，29]，笔者研究结果与此相一致。提示奥沙利铂诱导的外周神经病变导致了NGF的下调，而通过电针和CO2激光灸等方法可能部分恢复 NGF的表达，从而改善了外周神经病变的程度，进而改善了奥沙利铂诱导的痛觉过敏。而NGF作为传递疼痛的重要分子，可以调控一些与疼痛相关的功能蛋白的表达从而诱发疼痛[30]。特别是在背根神经节和脊髓 NGF介导的信号通路的改变，往往影响传入感觉信号的调节，并最终导致神经性疼痛的发展[31]。一项针对糖尿病性神经病患者的Ⅱ期试验发现，给予 NGF可减轻神经性疼痛[32]，而Ⅲ期试验却发现与安慰剂相比，两组神经病变症状无差异[33]。可见 NGF信号与神经保护及神经性疼痛状态之间关系极为复杂。坐骨神经中NGF信号在OIPN中的作用有待进一步研究。

综上，电针和CO2激光灸改善奥沙利铂所致周围神经毒性，可能与调节坐骨神经TRPA1和NGF水平有关。