约氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶5抗血清对有性阶段生长抑制作用的研究①

周 丹 于园超 洪明阳 朱晓彤 崔立旺

(中国医科大学免疫学教研室，沈阳 110122)

蛋白质可逆磷酸化修饰是存在于所有生物体的重要生理机制，在细胞信号通路传导和细胞周期调控中至关重要。蛋白质磷酸化和去磷酸化过程分别由激酶和磷酸酶调控。近年来磷酸化修饰中相关蛋白磷酸酶和激酶已作为药物靶点进行广泛研究[1，2]。蛋白磷酸酶(phosphoprotein phosphatases，PPase)根据序列同源性和三维结构相似性可分为丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(phosphoserine and phospho-threonine residues phosphatases，PPPs)、Mg2+依赖的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PPMs)和酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPs)3个家族[3]。PPPs的主要成员包括：PP1、PP2A、PP2B和PP7等[4，5]。恶性疟原虫PP1和PP2A在红内期表达，且PP1可影响疟原虫DNA的合成[6]；恶性疟原虫PP7在不同阶段表达水平具有明显差异：在早期滋养体中几乎不表达，在晚期裂殖体阶段表达水平达到峰值[7]。

丝/苏氨酸蛋白磷酸酶5(PP5)属于PPP家族成员，PP5的主要结构特征包括高度保守的PP2Ac结构域以及四肽重复序列(TPRs)的N末端延伸，这3个四肽重复序列是PP5蛋白特有的[8，9]。TPR结构域由一系列反平行的α螺旋组成，它们通过疏水相互作用聚集在一起形成一个摇篮状的沟槽，被认为参与了许多重要调节蛋白的结合，如热休克蛋白90(heat shock proteins 90,Hsp90)[10，11]。TPR和蛋白C端可形成环形结构，抑制PP2Ac结构域功能，因此在PP5蛋白发挥去磷酸修饰时起调控作用。已有研究表明，PP5在多种原虫生长过程中起作用：PP5表达水平降低可导致柔嫩艾美耳球虫原虫(eimeriatenellaPP5，EtPP5)二代裂殖子凋亡[11]；敲除布鲁氏锥虫PP5(trypanosomabruceiPP5，TbPP5)基因可抑制锥虫生长[7]；伯氏疟原虫(plasmodiumbergheiPP5，PbPP5)基因缺失可抑制有性阶段发育[12]；恶性疟原虫PP5(plasmodiumfalciparumPP5，PfPP5)在红内期表达，并与Hsp90相互作用[13]。综上，PP5蛋白在原虫生长发育中具有重要作用。

鉴于PP5蛋白在各种属原虫生长发育中发挥的重要作用，本文通过生物信息学方法预测约氏疟原虫PyPP5(Py04697)优势抗原表位，扩增后克隆至原核表达载体，获得PyPP5重组蛋白后免疫小鼠获得抗血清。观察发现，PyPP5蛋白具有免疫原性和免疫反应性。同时，抗-PyPP5免疫血清在体内外均具有传播阻断效果。上述研究结果为高效疟原虫传播阻断疫苗的研发奠定了实验基础。

1 材料与方法

1.1材料 BALB/c小鼠(6～8周龄，雌性)；约氏疟原虫基因组DNA(gDNA，中国医科大学免疫学教研室)；KOD-Plus(Toyobo)；FastDigest BamHⅠ(Thermo Fisher Scientific)；FastDigest NotⅠ(Thermo Fisher Scientific)；ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(Vazyme)；快速质粒小提试剂盒(TIANGEN)；LB Broth(Solarbio)；RPMI1640(Gibco)；TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit v2.0(TaKaRa)；PierceTMECL Plus Western blot Substrate、HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads、6×His Tag Monoclonal Antibody,HRP(Thermo Fisher Scientific)；胎牛血清(Hyclone)。

1.2方法

1.2.1约氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶5(Py04697，PyPP5)基因合成及原核表达载体构建 以约氏疟原虫gDNA为模板扩增PyPP5目的片段，琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收纯化。pET32a(+)原核表达载体经BamHⅠ和NotⅠ限制性内切酶37℃孵育2 h后，采用Exnase Ⅱ(Vazyme)重组酶与纯化后的PyPP5目的片段37℃ 30 min进行重组反应。将连接后的pET32a(+)-PyPP5表达载体转化入感受态细胞中，筛选酶切鉴定和测序正确的阳性克隆株进行rPyPP5诱导。

1.2.2重组蛋白的表达、纯化与抗血清的制备 挑取pET32a(+)-PyPP5阳性克隆加入 LB培养基(500 ml)中，37℃摇至OD值为0.2～0.4，加入1 mmol/L IPTG 19℃过夜诱导。9 000 r/min离心5 min收菌，沉淀用8 ml天然结合缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4·2H2O，30 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH8.0)吹打混匀后超声。超声开3 s，关9 s，5 min/次，共4次，冰上进行。超声后12 000 r/min离心15 min，收集上清中可溶性蛋白。采用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads纯化PyPP5重组蛋白(rPyPP5)。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化后的PyPP5重组蛋白，考马斯亮蓝染色检测蛋白表达和纯化情况。免疫血清制备：6～8周龄BALB/c雌性小鼠20只，PBS免疫组和rPyPP5免疫组各10只。初次免疫中，rPyPP5(50 μg/只)与完全弗氏佐剂使用三通管充分混合后皮下免疫小鼠。两周和四周后进行二免和三免，rPyPP5与不完全弗氏佐剂使用三通管充分混合后皮下免疫。三免后第10天眼球取血获取抗-PyPP5免疫血清。

1.2.3ELISA检测抗-PyPP5免疫血清中特异性抗体滴度 采用10 μg溶解在碳酸盐缓冲液中的rPyPP5包被96孔酶标板，4℃过夜。PBS-T洗6次后，将免疫血清从1∶1 000稀释至1∶256 000，每孔加入100 μl，37℃孵育2 h后PBS-T洗3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000)，37℃孵育1 h后PBS-T洗6次，加入邻苯二胺和H2O2进行反应，加入浓硫酸终止反应，波长492 nm处检测OD值。

1.2.4提取约氏疟原虫不同阶段的蛋白 采用1×107个Py 17XL活虫感染昆明鼠。裂殖体纯化：感染后第3天无菌心脏取血，加入到裂殖体培养基(25%胎牛血清+RPMI1640+链霉素+青霉素)中，37℃培养20 h。培养后用55%的Nycodenz，2 500 r/min离心30 min，分离纯化成熟裂殖体。环状体纯化：纯化后的裂殖体尾静脉回输至小鼠体内，涂片观察。至环状体时，采用80%的Nycodenz 进行纯化。滋养体纯化：纯化后的裂殖体尾静脉回输至小鼠体内，涂片观察。至滋养体时，采用70%的Nycodenz 进行纯化。配子体纯化：感染后第3天喂食磺胺嘧啶(20 mg/L)，48 h后采用48%的Nycodenz分离纯化配子体。动合子纯化：感染后第3天，心脏采血，1 ml全血加9 ml动合子培养基(25%胎牛血清+RPMI1640+链霉素+青霉素，pH8.3)，19℃，24 h体外进行动合子培养后，采用62%Nycodenz 分离纯化动合子期原虫。蛋白提取：上述纯化后各阶段约氏疟原虫用0.15%saponin冰上裂解8 min，13 000 r/min离心5 min，PBS-PI清洗至上清无红色(去除血红蛋白)，向沉淀中加入适量的M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent(ThermoFisher)。采用Western blot方法检测约氏疟原虫各阶段蛋白的表达情况。

1.2.5抗-PyPP5免疫血清对原虫有性阶段生长抑制作用的观察 采用1×107个Py 17XL活虫感染已连续腹腔注射苯肼(200 μl；6 mg/ml)2 d的BALB/c小鼠。感染后第3天，将1∶5倍稀释的rPyPP5/PBS免疫的小鼠血清加入动合子培养基(25%胎牛血清+RPMI1640+链霉素+青霉素)中，25℃条件下，尾血与动合子培养基1∶4混合培养15 min，培养结束后取1 μl混合液涂片，在光学显微镜下计数配子体出丝数。取10 μl尾血加入90 μl动合子培养基中(培养基中加入1∶5倍稀释的rPyPP5/PBS免疫的小鼠血清)，19℃培养24 h后，取1 μl涂片，用4%多聚甲醛和0.007 5%戊二醛固定。抗-Pys25(1∶200)室温孵育90 min，羊抗鼠Alexa fluor 488抗体(1∶500)室温避光孵育60 min。采用荧光显微镜计数动合子数目和动合子转化率。蚊饲实验：直接蚊饲实验前1 h，rPyPP5免疫组和PBS免疫组分别尾静脉注射100 μl抗-PyPP5免疫血清和PBS免疫血清，蚊饲2 h，7 d后解剖蚊胃计数卵囊数量。

1.3统计学处理 实验数据采用GraphPad Prism 6.01统计软件进行分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1重组蛋白表达纯化及免疫血清特异性IgG抗体滴度检测 本研究中通过Infusion克隆方法成功构建了pET32a (+)-PyPP5原核表达载体。SDS-PAGE电泳分析可见rPyPP5(约50.4 kD)的表达，蛋白大小与预测蛋白分子量一致(图1A)。ELISA检测结果显示，应用rPyPP5免疫小鼠收集的血清与对照组相比，抗体特异性水平升高，且抗-PyPP5免疫血清抗体滴度在1∶128 000时与对照组有显著差异(P<0.05，图1B)。

图1 rPyPP5表达检测及免疫血清ELISA结果Fig.1 Expression of recombinant rPyPP5 and ELISA results of immune serumNote:A.Detection of recombinant rPyPP5 by coomassie brilliant blue staining；B.ELISA results of anti-serum obtained by immunizing mice with recombinant rPyPP5.PBS.Anti-serum obtained by PBS immunization;PyPP5.Anti-serum obtained by immunizing mice with recombinant Plasmodium yoelii PP5 protein.*.P<0.05；**.P<0.01.

2.2PP5在约氏疟原虫各阶段的表达情况 提取约氏疟原虫不同阶段的蛋白质进行SDS-PAGE分离，并用抗-PyPP5免疫血清进行检测。结果显示，约氏疟原虫PP5蛋白在环状体、滋养体、裂殖体、配子体、动合子等阶段均有表达，且在裂殖体期表达达峰值(图2A)。采用抗PyPP5免疫血清进行的约氏疟原虫各发育阶段的免疫荧光检测结果显示：PP5蛋白在环状体、裂殖体、配子体和配子阶段定位于原虫胞浆(图2B)。

图2 PyPP5各阶段表达和定位情况Fig.2 Expression and location of PyPP5 at each develop-ment stageNote:A.Western blot of Plasmodium yoelii cell lysates with anti-PyPP5 serum.R.Ring;T.Trophozoite;S.Schizont;G.Gametocyte;O.Ookinete.Positions of pre-stained molecular mass markers are indicated.Western blot with anti-Hsp70 serum is shown as loading controls.Arrows indicate PyPP5 and Hsp70 proteins，respectively.Lower panel shows the bands intensity of PyPP5 protein at each stage.Signal intensity was normalized by Hsp70 results.B.Localization of PP5 proteins at Plasmodium yoelii each develop-ment stage.

2.3抗-PyPP5免疫血清对有性阶段原虫的作用 体外免疫血清抑制实验显示，抗-PyPP5免疫血清使配子体出丝数目减少29.89%(P<0.05，图3A)，与PBS免疫血清相比差异具有统计学意义，提示抗-PyPP5免疫血清对雄配子体出丝有抑制作用。

疟原虫动合子培养基中加入1∶5倍稀释的抗-PyPP5免疫血清与疟原虫培养24 h后可观察到动合子形成减少，动合子数目减少38.59%(P<0.05，图3B)。同时，经过1∶5倍稀释的抗-PyPP5免疫血清使动合子转化减少64.30%(P<0.01，图3C)。上述结果提示抗-PyPP5免疫血清对动合子的形成和成熟有抑制作用。

与PBS免疫血清相比，吸食过继免疫-PyPP5免疫血清小鼠血液的蚊卵囊数目减少70.23%(P<0.001，图3D)。吸食过继免疫-PyPP5免疫血清小鼠血液的蚊感染率下降7.14%(表1)。上述结果提示抗-PyPP5免疫血清对蚊胃内卵囊形成有抑制作用。

图3 抗-PyPP5免疫血清对有性阶段原虫的作用Fig.3 Effect of anti-PP5 serum on sexual stageNote:A.Effect of anti-PyPP5 serum on male gametocyte exflagellation；B.Effect of anti-PyPP5 serum on ookinete number；C.Effect of anti-PyPP5 serum on ookinete conversion rate；D.Effect of anti-PyPP5 serum on oocysts formation.PBS.Anti-serum obtained by PBS immunization;PyPP5.Anti-serum obtained by immunizing mice with recombinant Plasmodium yoelii PP5 protein.*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

表1 抗-PyPP5免疫血清传播阻断效果Tab.1 Transmission blocking effect of anti-PyPP5 serum

3 讨论

蛋白质磷酸化在疟原虫有性生长发育阶段具有重要作用[7]。蛋白磷酸酶由PPP、PPM和PTP三个基因家族编码[13]。PP5属于PPP家族成员，具有多种功能，包括类固醇信号转导、MAP激酶级联的衰减以及调节细胞周期等[14]。PP5在约氏疟原虫中的功能尚未有研究报道。

传播阻断疫苗(transmission blocking vaccine，TBVs)经典候选抗原，包括受精前的靶抗原如P48/45、P230，受精后的靶抗原P25以及蚊虫中肠靶抗原[15]。P48/45传播阻断效果明显，但其在体外无法形成正确空间结构而导致研究受阻。恶性疟原虫Pfs230抗体可在蚊胃阻断疟原虫的发育，但是其阻断活性依赖于补体，补体失活时，Pfs230抗体的阻断活性消失[16，17]。受精后靶抗原P25为动合子表面蛋白，具有很强的免疫活性，但其存在有限的抗原多态性[18]。本研究发现，约氏疟原虫PP5重组蛋白免疫血清具有良好的免疫原性和抗原性，提示约氏疟原虫PP5蛋白可作为传播阻断疫苗候选抗原。有研究发现，伯氏疟原虫PP5免疫血清1∶5倍稀释时可使配子体出丝数目和动合子转化率减少[19]。而在本研究中，约氏疟原虫PP5免疫血清1∶5倍稀释时使配子体出丝率和动合子转化率分别下降29.89%和64.30%。上述研究结果提示，约氏疟原虫PP5免疫血清对配子体出丝、部分动合子的形成和成熟均有抑制作用。同时，本研究发现PyPP5免疫血清对蚊胃内卵囊形成有抑制作用。以上结果说明PyPP5免疫血清对约氏疟原虫有性阶段的生长发育有抑制作用。

综上所述，本研究采用原核表达技术获得约氏疟原虫PP5蛋白，并制备PyPP5特异性免疫血清。另外，本研究通过体外抑制实验证实PyPP5免疫血清可以有效抑制有性阶段原虫的生长发育，从而为TBVs的研发提供了一定的实验基础。