MALAT1基因rs3200401、rs664589位点多态性在广西人群的分布①

王 艳 刘纯宏 谭 昙 雷 茗 黄艳云 蓝 艳 韦叶生

(右江民族医学院附属医院检验科，百色 533000)

长链非编码RNA (long non-coding RNA，lncRNA)是长度超过200个核苷酸，无编码蛋白能力的RNA分子，但参与细胞增殖，分化、代谢、凋亡和免疫。转移相关的肺腺癌转录物1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1,MALAT1)是位于染色体11q13.1，长度约为8 kb的lncRNA。研究证实MALAT1广泛参与基因剪切和表达调控，与突触形成、血管生长等各类生理功能紧密相关[1]。最新研究发现，MALAT1参与免疫反应的多种生物学过程。例如，MALAT1海绵miR-195诱导细胞程序死亡-配体1的表达从而抵抗CD8 T细胞毒性作用[2]。此外，作为 miR-155的竞争性内源性RNA调节炎症因子分泌，可促进树突状细胞向耐受表型的转变，并与免疫耐受密切关联[3]。据报道MALAT1的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)与疾病风险有相关性，且相关性受到人口环境因素影响[4,5]。截至目前，MALAT1基因rs3200401、rs664589多态性在广西人群与其它地区人群的比较尚未见报道。本实验通过SNPscan 高通量分型技术检测两位点多态性，并与HapMap数据库比较，有助于认识不同地区人群MALAT1基因多态性的分布差异，为后续MALAT1相关疾病提供遗传学参考依据。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料 2018年6月至11月，从本院体检中心随机纳入男104例、女91例，共195例体检人员，年龄20～79岁，平均年龄(41.79±12.13)岁。纳入标准：样本居住地与籍贯均为广西，彼此间无亲缘关系；各项实验室检查指标合格。排除标准：心、肝、肾、肿瘤以及遗传免疫等疾病被排除。研究方案获得本院伦理委员会审批备案，研究对象均同意采集血液样本参与实验。

1.1.2主要仪器与试剂 JYO2S型紫外分析仪(北京君意东方公司)； S100型Thermal Cycler扩增仪(美国Bio-Rad公司)；ABI3500型Genetic Analyzer分析仪(美国ABI公司)；人类基因组DNA提取试剂盒(中国北京天根生化科技有限公司)；人86SNP位点SNPscan 检测试剂盒(中国上海天昊生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1样本DNA制备 实验对象需要空腹8 h以上，于次日早上8点采集静脉血3 ml于EDTA-K2抗凝管。按照北京天根公司离心柱法说明书规范提取DNA，并分装储存，放置-20℃备用。选取DNA样本OD260/280值1.7～2.0、浓度20～50 ng/μl的合格样本用于后续基因分型实验。

1.2.2引物设计与合成 在NCBI 选取包含人rs32-00401、rs664589适宜长度的DNA序列，输入 Primer Premier 3.0 在线软件设计引物，并交给上海天昊公司合成引物序列。目标位点rs3200401C/T的等位基因鉴别引物长度27 bp,序列为5′-GCATTTACTTGCCAACAGAACAGAGAG-3′，5′-GCATTTACTTGCCAACAGAACAGAGAA-3′，通用引物长度25 bp，序列为5′-ACCTGAAGTCAAGACAACTGCATTC-3′。rs664589位点等位基因引物鉴别长度为22 bp，序列为5′-TGGCAATTAGTTGGCAGTGTCC-3′，5′-TGGCAATTAGTTGGCAGTGTCG-3′，通用引物长度21 bp，序列为5′-TGTTACGGTTGGGATTGGTGG-3′。

1.2.3SNPscan分型检测 严格按照人86 SNP位点SNPscan检测定制试剂盒的使用说明书操作，目标位点基因型由Gene Mapper软件质量控制并读取。

1.3统计学分析 Hardy-Weinberg分析样本群体的遗传代表性(P>0.05提示群体遗传平衡)。直接计数法表达统计两位点的基因型与等位基因频率，利用SPSS20.0软件进行统计学数据分析，其中(组间基因型和等位基因)采用χ2检验和Fisher精确概率法，P<0.05提示两地人群的遗传变异差异有统计学意义。

2 结果

2.1MALAT1基因rs3200401、rs664589位点多态性 测序表明，rs3200401位点存在CC(74.9%)、CT(23.6%)和TT(1.5%)3种基因型，等位基因C、T频率为86.7%、13.3%。rs664589位点基因分型为CC (62.6%)、CG(35.4%)以及GG(2.0%)，等位基因C、G频率为80.3%、19.7%。基因测序图如图1、2。

图1 MALAT1基因rs3200401C/T测序图Fig.1 Sequencing map of genotype for MALAT1 gene rs3200401C/TNote:A.CC genotype;B.CT genotype;C.TT genotype.

图2 MALAT1基因rs664589C/G测序图Fig.2 Sequencing map of genotype for MALAT1 gene rs664589C/GNote:A.CC genotype;B.CT genotype;C.TT genotype.

2.2广西人群MALAT1基因rs3200401、rs664589位点多态性分布 样本人群目标位点基因型数据满足哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)，P为0.772、0.104均大于0.05，表明所选样本遗传平衡，见表2。rs3200401C/T和rs664589C/G的基因型在男女样本的分布差异均无统计学意义，见表1。

表1 广西人群MALAT1基因rs3200401、rs664589位点的多态性分布[例(%)]Tab.1 Polymorphism distribution of rs3200401 and rs664589 of MALAT1 gene in Guangxi population[n(%)]

2.3广西人群MALAT1基因rs3200401、rs664589位点多态性与其他区域人群的比较 广西健康人群MALAT1 rs3200401位点基因型、等位基因分布频率同HapMap-JPT、HapMap-CEU人群的分布差异有统计学意义(P<0.05)；rs664589位点基因型与等位基因分布同HapMap-CHB、HapMap-JPT、HapMap-CEU和HapMap-YRI的分布差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2、3。

表2 不同区域人群MALAT1基因rs3200401、rs664589位点基因型分布比较[例(%)]Tab.2 Comparison of genotype distribution of rs3200401 and rs664589 of MALAT1 gene in different populations[n(%)]

表3 不同区域人群MALAT1基因rs3200401、rs664589位点等位基因频率的比较[例(%)]Tab.3 Comparison of allele frequencies of rs3200401 and rs664589 of MALAT1 gene in different populations[n(%)]

3 讨论

MALAT1又被称为复核集常染色体转录产物2(nuclear-enriched abundant transcript 2，NEAT2)，包括定位于核内的RNA和胞质的tRNA样小RNA即mascRNA，成熟的MALAT1转录本定位在细胞核的核斑区。尽管其5′ 端无帽子结构， 3′ 端 无 ploy(A)尾，但在哺乳动物中保守稳定，研究表明这与3′端的三螺旋结构紧密相关[6]。最初，MALAT1作为肺癌标志物被发现，后续研究表明在其他癌症中也扮演重要角色，影响肿瘤细胞的增殖、分化和转移[7,8]。而新的证据表明MALAT1的表达失调影响宿主免疫稳态，进而影响免疫相关疾病的发生发展。Zhao等[9]证实脂多糖诱导的巨噬细胞中MALAT1表达上调，并与NF-κB相互作用，抑制TNFα和IL-6的表达，参与微调天然免疫反应。而NF-κB信号级联反应涉及多发性硬化(multiple sclerosis，MS)以及实验性自身免疫性脑脊髓炎的发展[10]。在系统性红斑狼疮患者的单核细胞中，显著升高的MALAT1促进IL-21表达，并调控SIRT1途径参与狼疮发生与维持[11]。此外，MALAT1通过促进CTNNB1启动子甲基化抑制Wnt信号传导，继而抑制成纤维细胞样滑膜细胞的增殖和炎症，参与类风湿性关节炎疾病[12]。提示MALAT1有潜力成为免疫相关疾病的调节因子。SNPs即单个核苷酸发生转换或颠换，已成为探究疾病机制的重要途径。在遗传学中近距离的基因易形成连锁，标签SNP(Tag SNP)即代表着同一片段内所有SNP的类型，rs3200401、rs664589作为MALAT1基因的关键Tag SNP，有重要研究价值。目前，MALAT1在免疫反应中的重要功能逐渐显现，但其多态性与免疫疾病的关联研究仍然甚少。埃及学者探索了rs3200401变异与MS的风险关系，但在遗传模型中均未发现两者的相关性。值得注意的是，部分涉及MALAT1多态性与癌症的研究表明rs3200401、rs664589是重要功能性位点[13]。如rs664589突变子G可改变MALAT1与miR-194-5p的结合，促进结直肠癌的发生[14]。但rs3200401 C>T突变与肝癌风险的研究存在不一致的结论。针对台湾人群的研究显示携带 rs3200401突变型CT、TT 的吸烟者感染乙型肝炎病毒(HBV)的频率较高，而rs3200401C>T 变异、环境因素以及HCC风险的交互分析在广东人群中没有发现相关性[15，16]。上述样本来自不同地方，可能存在遗传背景差异，使得该位点与同种疾病风险不同。因此有必要研究MALAT1基因rs3200401、rs664589多态性在广西人群的分布征，为进一步探究本地相关疾病奠定基础。

本研究显示，MALAT1基因rs3200401、rs664589位点SNPs在广西人群性别间的差异无统计学意义(P>0.05)。进一步将实验数据与HapMap 数据库对比得出：rs3200401位点的C>T突变频率与北京和非洲人群的差异无统计学意义(P>0.05)，突变频率明显低于日本和欧洲，差异有统计学意义(P<0.05)。这可能与遗传背景相关，广西与北京、日本虽同属亚洲人群，但在饮食结构，生活习性以及海拔高度等方面与日本的差异更为明显，可能是造成与日本rs3200401位点多态性差异显著的原因之一。广西同欧洲、非洲地理位置相隔较远，遗传背景差异大易影响多态性分布。而非洲的经济相对落后，人口内流少，可能阻隔基因交流，使其与广西在rs3200401的C>T突变频率均相对较低，差异无统计学意义。rs664589位点C>G突变普遍，且在广西地区检测出少量突变纯合子GG基因型，HapMap公布的北京、日本、欧洲以及非洲地区未见纯合子突变型GG，广西与上述地区的分布差异有统计学意义(P<0.05)。这可能是由于基因突变存在累积效应，除上述地理位置以及饮食结构等遗传背景外，广西是多民族聚居之地，各民族间通婚普遍，这种区域特性可能使rs664589位点C到G的突变明显高于其他地区，加速了GG纯合子突变型的出现。实验结果也证实了遗传背景不同，基因突变的累积效应也存在差异，提示研究者遗传相关疾病的研究宜选取本土人群[17,18]。

综上，本次针对广西本土健康人群的研究发现不同地区MALAT1 rs3200401、rs664589位点突变程度不同。这为解释同种疾病的发病率、临床表现不同提供了数据支持，也为进一步探究MALAT1基因SNPs 在免疫疾病中的作用奠定基础。然而本研究属于小样本研究，可能存在选择偏倚。今后应增加样本量，进行年龄、民族等环境人口因素的多中心、前瞻性的研究，进一步验证实验结果。