芽囊原虫致病机制的研究进展

芽囊原虫(Blastocystis)是一种无运动细胞器的厌氧原虫，常寄居于人类和动物的肠道。该虫曾先后被认为是鞭毛虫的包囊、植物、酵母菌及真菌等，最终被归为不等鞭毛类生物(Stramenopiles)。芽囊原虫生活史中的形态多样，文献中报道有4种类型，分别是空泡型、颗粒型、包囊型及阿米巴型，其中空泡型最常见，典型特征是中央含有一个约占90%细胞总体积的空泡[1]。基于SSU-rDNA测序，现已报道的芽囊原虫包含17个亚型(subtype, ST)[2]，已在人类粪便中发现9个亚型(ST1-ST9)，其中ST1-ST4更为普遍，而在大多数人类流行病学研究中发现的最常见的是ST3，其次是ST1[3-6]。芽囊原虫感染呈世界性分布，并具有广泛的地理差异性。欧洲地区最常见的是ST3，其次是ST4、ST1，其他地区最常见的是ST3、其次是 ST1、ST2[7]，我国最常见的是ST3。从已公布的数据推断全球约有1～2亿人感染该虫[8]，发达国家的感染率约为0.5%～23%，由于卫生条件差、水和食物被污染等原因，发展中国家的芽囊原虫感染率高达27%～76%，当前我国的感染率约为0.1%～32.6%[9]。芽囊原虫感染相关的临床症状主要是腹痛、腹泻以及一些非特异性的胃肠道症状如恶心、呕吐等[10-11]。临床调查研究发现芽囊原虫感染与肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)、炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)有关[12-15]。研究表明芽囊原虫通过粪-口传播，主要寄居部位是盲肠和结肠，且芽囊原虫感染能引起促炎细胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α上调及不同程度的肠道病理变化。但该虫的具体致病机制尚不明确。近年来许多学者通过体外研究提出了几种芽囊原虫的致病机制，包括降解紧密连接蛋白引起肠上皮细胞通透性增加、细胞凋亡、上调肠道上皮细胞内的促炎细胞因子以及下调诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)。本文就芽囊原虫致病机制的最新研究进行综述。

1 体内研究

1.1传播 Yoshikawa等发现从实验室大鼠粪便中分离的RN94-9虫株能够通过口服感染大鼠，表明芽囊原虫的传播途径为粪-口传播，该研究还证实了包囊是该寄生虫唯一的传播阶段[16]， Moe等人还认为小鼠感染芽囊原虫具有年龄相关性，研究发现8周龄成年BALB/c小鼠不感染芽囊原虫，而幼年BALB/c小鼠(<3周龄)比成年小鼠更易感，并且芽囊原虫在免疫功能正常的小鼠中引起的感染具有自限性[17]。张红卫等人发现免疫抑制剂组小鼠比非免疫抑制剂组的肠黏膜超微结构病变更加严重，且小鼠粪便和肠道中的芽囊原虫虫体数量更多，表明芽囊原虫感染与宿主的免疫状况有关[18]。姚繁荣等人还发现芽囊原虫感染的持续时间与感染的虫体数量有关，且免疫功能低下的小鼠带虫感染持续时间明显长于免疫功能正常小鼠[19]。这些研究表明通过使用免疫抑制药物能增加芽囊原虫感染发病的严重程度，成功建立该病小鼠模型。

1.2寄居部位 Fayer等对自然感染芽囊原虫的猪进行研究后发现，在其空肠、结肠及盲肠的组织切片中观察到芽囊原虫，而在十二指肠或回肠中没有检测到。大多数情况下，在盲肠中发现的芽囊原虫为空泡型和颗粒型，而在结肠中仅发现包囊型。在盲肠中，芽囊原虫主要存在于管腔内容物中，组织切片显示芽囊原虫粘附于肠上皮，但在上皮层或固有层内均未观察到芽囊原虫[20]。姚繁荣等人发现经口感染的小鼠胃内有大量芽囊原虫寄生，且经直肠感染的小鼠的上消化道内均有虫体寄生，推测芽囊原虫可能以阿米巴样运动方式从直肠向上消化道运动，该研究提示芽囊原虫的寄居部位可能比以往报道的肠道范围更广[19]。Wang等发现芽囊原虫易定植于免疫功能受损的猪小肠中，表明宿主的免疫状况或肠道环境可能影响芽囊原虫的定植[21]。但芽囊原虫能否侵袭肠道一直存在疑问，并没有能证明该虫侵袭的实质证据。已有研究显示线虫在通过皮肤和肠道时会分泌透明质酸酶(水解透明质酸，促进组织液渗透)，Chandramathi等发现感染芽囊原虫的大鼠尿液中的透明质酸酶水平较感染前显著升高，表明该虫能够在宿主的肠道组织中具有侵入或穿透活性，提供了人芽囊原虫能侵袭结肠上皮的间接证据[22]。Elwakil等发现，感染高剂量芽囊原虫(4×107个)小鼠的盲肠的组织切片显示空泡型人芽囊原虫浸润固有层、粘膜下层和肌层，且肌层有空泡型芽囊原虫聚集[23]。Li等研究显示，ST1芽囊原虫滋养体能侵入SD大鼠的肠道固有层[24]，但是这一结果具有个体差异性。故推测芽囊原虫究竟是否具有侵袭性可能与它的毒力及宿主免疫状况有很大相关性。

1.3肠道组织变化 由于芽囊原虫最容易寄居的部位是盲肠和结肠，一些学者就针对该部位进行了组织学研究。感染芽囊原虫的小鼠盲肠和结肠的组织学检查显示固有层充血水肿、腺体结构不完整、黏膜下层不同程度的炎症细胞浸润、粘膜上皮脱落偶见坏死，并且远端结肠是病理改变最严重的部位[17-19]。还有研究认为炎症的严重程度与感染的剂量和亚型有关。Hussein等评估了感染不同亚型芽囊原虫的大鼠的病理生理变化、肠组织病理状态和肠上皮通透性，发现所有无症状的亚型(ST2和ST4)仅诱导轻度感染，而ST1虫株和大多数ST3虫株诱导的肠道病理变化更为严重[25]。Iguchi等对感染ST4芽囊原虫的大鼠进行肠组织学检测发现既没有粘膜浸润也没有炎症细胞浸润，但在感染1～3周后，盲肠粘膜中杯状细胞数量增加。此外，大鼠在感染2-3周后，盲肠粘膜中促炎细胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α的表达显著上调，而上皮紧密连接蛋白和闭合蛋白的表达没有显著变化，表明盲肠上皮的结构完整性没有受到严重的影响[26]。Yan等发现在无症状患者中仅检测到ST2虫株，而在有症状患者中最常见的是ST1虫株[27]。这些研究表明肠道症状与感染的芽囊原虫亚型的致病性有关。

以上这些研究通过盲肠内接种芽囊原虫滋养体或包囊灌胃的方式建立了芽囊原虫感染动物模型并确定了芽囊原虫的传播途径、寄居部位以及可能引起的肠道病理变化，但目前没有任何一项研究能够满足科赫法则[28](用来确定侵害性病原物的操作程序，包括4个步骤：I. 在每一病例中都出现相同的微生物，且在健康者体内不存在；Ⅱ. 要从宿主分离出这样的微生物并在培养基中得到纯培养；Ⅲ. 用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的宿主，同样的疾病会重复发生；Ⅳ. 从试验发病的宿主中能再度分离培养出这种微生物)。因此，需要建立合适的动物模型以进行下一步研究。

2 体外研究

2.1肠道通透性增加 Mirza等将ST7芽囊原虫活虫体及其裂解液在与Caco-2细胞(人结肠腺癌上皮细胞)共培养后，虫株的半胱氨酸蛋白酶诱导Rho激酶/肌球蛋白轻链磷酸化导致紧密连接蛋白ZO-1降解和F-肌动蛋白重组，使肠道上皮通透性增加[29]。Puthia等发现ST4芽囊原虫能够使IEC-6细胞(大鼠小肠隐窝上皮细胞)F-肌动蛋白重组、降低跨膜电阻，从而增加肠上皮通透性[30]。Wu等研究发现，ST7和ST4芽囊原虫降解Caco-2细胞紧密连接蛋白具有差异性，前者能通过降解紧密连接蛋白ZO-1诱导破坏上皮屏障，导致上皮细胞通透性增加，但后者对肠道上皮的作用却微乎其微。该研究还发现两个ST4虫株(WR-1和 S-1)与肠道的粘附程度可忽略，而ST7亚型虫株(ST7-H)相较于其它ST7虫株与宿主上皮细胞的粘附程度最大，并能最大程度地诱导上皮通透性增加，表明虫株与宿主细胞的粘附程度与诱导通透性增加相关，并且亚型间和亚型内均存在差异性[31]。还有研究发现肠上皮细胞表面的半乳糖能防止ST7-H粘附肠上皮，从而抑制紧密连接蛋白ZO-1降解，表明虫株与半乳糖残基的结合在早期肠道屏障的损害中起着重要作用[32-33]。

2.2细胞凋亡 Puthia等发现在与ST4芽囊原虫活虫体及其裂解液共培养的IEC-6细胞中，凋亡细胞百分比分别比对照组显著增加了4倍和7倍，且实验组的IEC-6细胞中半胱天冬酶3(Caspase-3)的活性显著增加。该研究首次证明了芽囊原虫能诱导细胞凋亡[30]。Wu等发现人源性ST7虫株能诱导Caco-2细胞凋亡，而大鼠源性ST4虫株则无此类作用，表明芽囊原虫感染具有宿主特异性[31]。

2.3免疫调节 寄生虫的半胱氨酸蛋白酶在宿主细胞的侵入、免疫逃逸和毒力中起着重要作用。ST7和ST4芽囊原虫均具有半胱氨酸蛋白酶活性，能降解人分泌型IgA(sIgA)，促进芽囊原虫在体内存活，并且ST7虫株的半胱氨酸蛋白酶活性比ST4虫株高约两倍，提示芽囊原虫的半胱氨酸蛋白酶活性存在亚型间差异[3,34]。Mirza等研究发现，分别将ST7和ST4芽囊原虫与Caco-2细胞共培养后，Caco-2细胞通过表达iNOS(L-精氨酸转化为NO的限速酶)产生一氧化氮(NO)启动防御机制。结果ST7虫株下调iNOS的表达抑制NO的产生，但ST4虫株无此作用。该研究还发现ST7虫株的精氨酸酶活性比ST4虫株更高，可能有助于ST7虫株逃避宿主的NO防御反应[35]。

芽囊原虫能上调促炎细胞因子的表达。Puthia等发现ST4虫株活虫体及其裂解液的半胱氨酸蛋白酶诱导T84细胞(人结肠癌细胞)中的IL-8上调，且这种上调是由NF-κB介导的[36]。伍玲园等人的研究显示小鼠感染芽囊原虫能促进促炎细胞因子IL-17和IL-23高表达，从而诱导肠道炎症的发生[37]。Mei等人发现ST7和ST4芽囊原虫活虫体及其裂解液产生的丝氨酸蛋白酶能诱导小鼠巨噬细胞丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶活化，上调促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达[38]。Long等发现将ST1虫株与T84细胞和HT-29细胞(人结肠癌细胞)共培养24小时后能诱导IL-8和GM-CSF上调[39]。

综上，通过对肠上皮细胞与芽囊原虫虫体及虫体裂解液共培养进行研究后提出了芽囊原虫的几种致病机制[40]，包括通过降解紧密连接蛋白导致肠上皮细胞通透性增加、细胞凋亡、诱导肠道上皮细胞内的促炎细胞因子表达上调以及下调iNOS。Wawrzyniak等从一株ST7虫株的培养上清液中纯化并鉴定了2个半胱氨酸蛋白酶，即18 kDa的组织蛋白酶B(cathepsin B)和位于细胞表面的31 kDa的豆荚蛋白酶(legumain)。推测它们可能是芽囊原虫潜在的毒力因子[41]。Wu等的研究还表明，上述legumain可能对芽囊原虫的生存有促进作用[31]。Puthia等的研究结果首次表明中央空泡可能作为半胱氨酸蛋白酶的储库[36]，这就可以解释为什么在一些研究中发现虫体裂解液比活虫体对宿主产生的影响更为严重。

3 结论与展望

体内外实验研究芽囊原虫对肠道的影响，该虫既能定植于肠腔表面并能粘附肠上皮又能逃避宿主免疫反应，还能降解紧密连接蛋白ZO-1、诱导细胞凋亡和增加肠道通透性，并且鉴定了2种潜在的毒力因子。芽囊原虫还具有免疫调节作用，包括降解IgA、抑制iNOS、上调肠上皮细胞内的促炎细胞因子IL-8和GM-CSF以及小鼠巨噬细胞的IL-1β、IL-6和TNF-α，这些研究均表明了芽囊原虫的致病潜力，但其致病性仍然存在争议，目前没有实验满足科赫法则，因此需要建立合适的动物模型来研究芽囊原虫与宿主间的相互作用。近年来越来越多的研究发现，肠道疾病往往与肠道菌群失调有很大相关性，菌群失调也有可能是造成肠道疾病的一个重要因素。Casén等研究发现，80%的缓解期IBD患者和73%的IBS患者存在肠道菌群失调，而健康人群仅有16%[42]。Nourrisson等研究发现芽囊原虫感染能引起人肠道内双歧杆菌属(Bifidobacteriumspp)和普拉梭菌属(Faecalibacteriumprausnitzii)的含量降低[43]，而这两种细菌有抗肠道炎症的作用[44],该研究首次表明芽囊原虫能引起肠道菌群的改变。Yamamoto等研究发现芽囊原虫是克罗恩病(属于IBD的一种)患者最常感染的寄生虫，并且该虫还能导致疾病复发[45]，但是否由于感染芽囊原虫引起这两种细菌减少使得疾病复发目前尚不明确。Audebert等的研究显示，与无芽囊原虫感染者相比，芽囊原虫感染患者的肠道具有更高的细菌多样性。此外，芽囊原虫感染患者在纲(Class)的级别上具有更高丰度的梭状芽胞杆菌(Clostridia)，在科(Family)的级别上具有更高丰度的瘤胃球菌(Ruminococcaceae)和普雷沃氏菌(Prevotellaceae)(这3种细菌有助于维持肠道稳态)，而肠杆菌(Enterobacteriaceae)在未感染芽囊原虫人群中更丰富，故推测芽囊原虫感染并不与通常在代谢性或感染性肠道疾病以及下消化道炎症造成的肠道菌群失调相关，而是与健康的肠道菌群相关[46-47]。这些研究提示我们，芽囊原虫感染在一定程度上可能有调节肠道菌群的作用，但芽囊原虫是否能通过改变肠道菌群来刺激宿主免疫应答目前尚不明确，这是芽囊原虫未来的一个重要研究方向。

利益冲突：无

本文引用格式：孙沁, 严宜明. 芽囊原虫致病机制的研究进展[J]. 中国人兽共患病学报, 2019,35(4):345-349,354. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.036