辐射制备的水溶性CdS量子点对小鼠胚胎成骨前体细胞的毒理性研究*

李婷婷，柳 国， 陈洪国，李月生，吴鸣虎

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院核技术与化学生物学院)

硫化镉量子点(CdS QDs)是一种典型的半导体无机晶体，纳米尺寸从2～10 nm不等。由于其独特的光化学性质，在太阳能、晶体管、光电、磁性、生物标记、光催化、生物传感器和生物医学等领域得到了广泛的应用[1-3]。然而，大多数CdS QDs在体外和体内[4]均具有毒性，毒性评价和抑制毒性是其在生物领域[5]安全应用必须解决的关键问题。幸运的是，已经有报道对不同合成方法的CdS量子点的毒性及其相关机理等进行了前期探讨[6-7]。

目前报道的CdS量子点合成方法主要有溶剂热法、水热法、热注入法、微波辅助法、反相胶束法、微乳液法和生物法等[8-10]，其中溶剂热法和水热法为最常用的方法，但它们各有优缺点。

近年来，电离辐射法(电子束或伽玛射线辐射)是一种在环境条件下制备CdS量子点的方法，无化学污染、毒性低、快速简便[9-14]。有作者[15]采用射线辐照制备了比表面积大、平均孔径约为9.4nm的CdS QDs；也有作者[16-17]报道利用射线辐照合成CdS纳米棒，并研究了对Cd2+浓度、配体摩尔比、辐射吸收剂量和时间的影响。另一方面，电子束辐射制备CdS量子点也受到了广泛的关注[18-20]。Mostafavi等[21]报道了用2 MeV电子束辐射法制备Cd2+和巯基丙酸(MPA)溶液的CdS簇。结果表明，随着辐射剂量和时间的增加，镉团簇的粒径和分布呈增大和变宽的趋势。Ha等[22]也采用CdCl2和MPA的混合溶液，通过10MeV电子束辐射制备了CdS QDs，发现在高浓度MPA配体修饰下，CdS QDs的表面缺陷可以大大降低。

鉴于CdS量子点的毒性可能取决于多种因素，如尺寸、电荷、成分、浓度、封盖材料、官能团以及机械、氧化和光解稳定性等。因此，很难从报道的研究中提取出明确的结论[23-25]。Nagy等[26]认为电荷和配体可能是影响量子点毒性的最重要因素。另一方面，与配体较短的量子点相比，暴露于配体较长的量子点的细胞增殖能力较低[27-28]。Su等[29]也发现量子点的细胞毒性是由量子点的表面包衣分子引起的，即量子点表面包衣官能团(如-NH2和-COOH)。许多研究表明[30]：在一定尺寸范围内的量子点中，较小的尺寸比较大的尺寸的细胞相容性更差。实际上，重金属离子最具挑战性的是可以在生物体内释放在金属基量子点，这不可避免地导致毒性[7]。

本文以硫代乙醇酸(TGA)和巯基丙酸(MPA)为配体，在室温下，原位辐射制备了不同粒径的水溶性CdS量子点。重点评价了不同配体和不同粒径大小的CdS QDs对小鼠胚胎成骨前体细胞(MC3T3-E1)细胞毒性的影响，同时分析其细胞毒性行为的可能原因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验试剂与细胞株

巯基丙酸、硫代乙醇酸、二甲基亚砜、Hoechst 33342荧光染色试剂、PI均购自美国西格玛试剂有限公司。尿素粉购自国耀(中国)有限公司。异丙醇和氯化镉购自萨恩化工科技有限公司(中国)。小鼠胚胎成骨前体细胞(MC3T3-E1)购自中国科学院细胞库(ATCC CRL-2594)。胎牛血清(FBS)购自Gibco Invitrogen公司， Dulbecco改良鹰型培养基 (DMEM)和青霉素-链霉素溶液(100X)购自美国希克龙公司。

1.1.2 实验仪器

傅里叶变换红外光谱仪(NICOLET 5700，美国)；x射线衍射测量(LabX XRD-6100，日本)；荧光光谱光度计(LS-55，美国珀金埃尔默)；细胞培养箱(Thermo，美国)；倒置荧光光谱法(DSY2000X，中国重光)；1MeV电子束加速器(Wasik，美国)。

1.2 方法

1.2.1 电子束辐射制备MPA-CdS量子点和TGA-CdS量子点

原位电子束辐射制备MPA-CdS量子点与TGA-CdS量子点方法相同(如图1所示，封二)。MPA-CdS量子点制备过程如下：取0.05mol的CdCl2和一定量的MPA溶液，将MPA与CdCl2的摩尔比保持在5∶1，然后进行0.5h的超声振动，用2M NaOH溶液将混合溶液的pH调节到10.0上。随后，在上述混合溶液中加入3mL异丙醇(IPA)作为清除剂，形成溶液A，用注射器注入聚乙烯袋(200mm×150mm)中厌氧条件下的LED。在室温下，样品以20kGy的剂量和5kGy/pass的剂量率通过1MeV电子加速器辐射后得到溶液B。最后，在室温暗处下，将溶液B连续搅拌48h。用离心法纯化MPA-CdS QDs，用超纯水洗涤3次，即可得到MPA-CdS QDs。

1.2.2 MTT测定

在37℃时，将MC3T3-E1细胞与10%胎牛血清、1%青霉素链霉素和5% CO2在DMEM中培养。采用MTT法测定量子点MPA-CdS量子点和TGA-CdS量子点的细胞毒性。以104个细胞/孔的细胞密度将细胞播散到96孔培养板上。隔夜孵化后与不同浓度的量子点MPA-CdS和TGA-CdS(500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625μg/mL)孵育24h和48h。在固定的时间内，每孔中加入20μL MTT(5mg/mL)，孵育4h。取出孔中溶液后，用150μL DMSO在轨道旋转器上震荡溶解紫色沉淀，避光10min。最后用分光光度计测量490nm处吸收光强度。重复试验三次。

1.2.3 Hoechst33342/PI双免疫荧光染色

收集的MC3T3-E1细胞接种于24孔板培养过夜。用31.25mol/mL MPA-CdS QDs和TGA-CdS QDs分别孵育贴壁细胞24h。PBS缓冲液洗涤细胞2次。加入0.01mol/L PBS稀释的Hoechst33342溶液，终浓度为10mg/L，孵育10min，加入终浓度为10mg/L的PI溶液，共孵育15min。蓝色荧光检测发现在400～500nm处检测到蓝色荧光，超过630nm处检测到红色荧光。重复试验三次。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 通过动态光散射进行水合颗粒尺寸测试

为了准确获得量子点的水化粒径，对不同辐射剂量下CdS量子点的粒径也进行了动态光散射表征(图2，封二)。在辐射剂量为5、10、15kGy时TGA-CdS QDs的平均粒径(图2a、b、c)为4.9、5.5、7.1nm。辐射剂量为10、20、30kGy时MPA-CdS QDs(图2d、e、f)的平均粒径为7.6、9.4、9.7nm。因为只能通过动态光散射来测量CdS QDs的水合颗粒粒径，使得结果大于实际颗粒大小[13]。另外，MPA-CdS QDs的平均粒径大于TGA-CdS QDs，这一趋势也符合舍勒公式计算的结果。同时，水合颗粒大小的半宽也随着辐射剂量的增加而增加，表明TGA-CdS QDs和MPA-CdS QDs的平均粒径分布也越来越不均匀。

2.2 倒置荧光显微观察

通过倒置荧光显微镜可以检测到TGA-CdS量子点和MPA-CdS量子点的强荧光特性。由图3a、b(封二)可知，TGA-CdS QDs和MPA-CdS QDs在不同配体处荧光颜色不同。特别是TGA改性后的TGA-CdS量子点呈黄色和绿色，不同于MPA-CdS量子点的橙色和黄色荧光。由于不同粒径的CdS量子点具有不同的荧光发射峰，从而显示出不同的荧光颜色。TGA-CdS量子点呈超薄膜状，而MPA-CdS量子点是粒子的聚集分布，可能不同辐射剂量下形成的配体修饰量子点的粒子大小和分布模式不同，这些信息参数也会影响后期的细胞毒性。

2.3 辐射吸收剂量对MPA-CdS QDs和TGA-CdS QDs的光谱特性的影响

不同辐射吸收剂量的MPA-CdS QDs(图4a、b，封二)和TGA-CdS QDs(图4c、d，封二)的紫外可见吸收光谱和荧光光谱图见图4。在辐射吸收剂量为10kGy时，20kGy和30kGy，在紫外可见吸收光谱中，MPA-CdS QDs 的吸光峰值为 314、360和372nm(图4a)，荧光光谱中MPA-CdS QDs的最大发射峰值为517、553和565nm(图4b)。随着辐射吸收剂量的增加，吸收峰的最大值变为红移，发射峰值最大值变窄，荧光发射峰强度同步变化较弱。考虑到量子点大小和荧光量子产量对细胞毒性的影响，选择20kGy的辐射吸收剂量作为以后实验的最佳辐射剂量。同样，在辐射吸收剂量为5、10和15kGy，在紫外可见吸收光谱中，TGA-CdS QDs的吸收峰分别是344、404和432nm(图4c)，TGA-CdS QDs荧光光谱的发射峰值最大值为472、550和483nm(图4d)。可以看到，随着辐射吸收剂量的增加，但发射峰值的最大值会变宽。同时，当辐射剂量为10kGy时，荧光发射峰值的强度最高，然后由于15kGy辐射剂量的结晶性能恶化而逐渐变强和分裂。在这里，有两个主要原因来解释这些现象。首先，由于辐射吸收剂量过大，可能触发CdS QDs的积累。其次，在CdS QDs的表面上引入了大量的S空缺和Cd空缺。TGA-CdS QDs的颗粒大小和表面缺陷也可能对MC3T3-E1细胞的后期细胞毒性产生一定的影响。

2.4 MPA-CdS QDs和TGA-CdS QDs对MC3T3-E1细胞活力的影响

采用MTT法研究了不同浓度的量子点对MC3T3-E1细胞的杀伤作用。如图5a(封二)所示，与TGA-CdS QDs共培养24h后，细胞存活率与TGA-CdS QDs浓度呈负相关。随着TGA-CdS QDs浓度的增加，细胞存活率显著下降，由(97.49±2.63)%下降到(48.04±4.93)%。当浓度低于31.25mol/mL时，细胞存活率由97.49%慢慢下降到84.18%。当浓度增加到62.5mol/mL时，细胞存活率迅速下降到60.97%。当浓度在62.5～500mol/mL时，细胞活力没有明显下降，稳定在50%～60%。与TGA-CdS QDs共培养48h后，细胞毒理作用也呈浓度依赖性。当TGA-CdS QDs浓度为3.90625μg/mL时，细胞存活率较高，接近88.64%。当浓度提高到500μg/mL时，细胞存活率急剧下降到41.66%。

将MC3T3-E1细胞与MPA-CdS QDs共培养，细胞毒性浓度和时间依赖性也如图5b(封二)所示。共培养24h后，随着MPA-CdS QDs浓度从3.90625 μg/mL增加到500 μg/mL，细胞存活率从92.95%下降到70.78%。48h时，在浓度62.5～125μg/mL的区域，细胞存活率明显下降，由88.35%下降到53.89%。其细胞毒性行为的一个可能原因是量子点在高浓度和长时间内通过内吞作用进入细胞，从而破坏细胞膜的完整性。线粒体等与细胞活力密切相关的细胞器也被破坏。

细胞分别与31.25 μg/mL MPA-Cd S量子点和TGA-Cd S量子点孵育24h，后用Hoechst33342/PI对细胞进行染色。

图6(封二)中Hoechst33342/PIdouble免疫荧光染色也观察到了细胞凋亡。Hoechst33342/PI染色剂分析显示，共培养组凋亡细胞多于对照组。对照组大部分细胞的细胞质高度明亮且均匀，细胞核呈淡蓝色。共培养组细胞颜色暗淡，有细胞质间隙。部分细胞核膜破裂，细胞核内形成较深的蓝色颗粒。俩者相比与TGA-CdS QDs共培养下，细胞核内蓝色颗粒颜色更深。

细胞毒性试验表明，在相同浓度和共培养时间下，TGA-CdS QDs的毒性大于MPA-CdS QDs。由于这两个量子点的水合粒径大小不同，因此，可以假设粒径大小可能是影响其细胞毒性的首要决定因素。粒径较小的TGA-CdS QDs容易进入细胞，引发其细胞毒性，而MPA-CdS QDs由于粒径较大，不易进入细胞，细胞毒性较弱。不同粒径大小的量子点可能诱导细胞凋亡，凋亡可能是细胞毒性的主要机制。Hoechst33342/PI染色显示凋亡细胞数量的逐渐增加与量子点暴露密切相关。

3 结 论

采用原位电子束辐射的方法，以巯基乙酸(TGA)和巯基丙酸(MPA)为配体，在室温下成功制备了两种不同配体和不同粒径的水溶性CdS量子点。这些CdS量子点通过一系列的形貌和结构表征得到了成功的验证。重点评价了不同配体和不同粒径的CdS QDs对小鼠胚胎成骨前体细胞(MC3T3-E1)细胞毒性的影响。细胞毒性结果表明，两种CdS QDs对MC3T3-E1细胞均有毒性和抑制作用。配体较短，粒径较小的TGA-CdS QDs暴露于MC3T3-E1细胞的细胞毒性，相对于配体较长、粒径较大的MPA-CdS QDs更显著。其细胞毒性行为的可能机制是表面配体与CdS量子点大小的协同作用，导致细胞膜完整性被破坏，与细胞活力密切相关的细胞器也被破坏。这项工作对利用电子束辐射方法去设计和优化新型量子点，并应用于生物标记、细胞成像和组织工程等领域具有重要的指导意义。