丁酸钠对1型糖尿病模型小鼠血糖、血清胰岛素水平和肠道菌群的影响*

徐海军，李 丹，王 磊，平东萍，爨淑楠，蒋 平，佘德勇

(1.皖西学院生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室)

糖尿病是一种胰岛素分泌缺陷(1型糖尿病)或胰岛素作用障碍(2型糖尿病)所致的、以高血糖为特征的代谢性疾病。1型糖尿病是一种先天家族遗传的自体免疫性疾病，其特征是T细胞介导的分泌胰岛素的胰岛β-细胞破坏，导致高血糖，患者需要终生胰岛素治疗。1型糖尿病多发于儿童和青少年，治疗不当或不及时极易引起并发症，严重时可导致患者死亡[1]。

糖尿病的治疗方法目前主要依靠药物治疗，同时配合饮食治疗和运动治疗。Zhao等[2]研究发现通过提供丰富多样的膳食纤维，可以使人体肠道内特定有益菌群升高，进而改善2型糖尿病的临床症状。该研究鉴定出来自3个门的15株产丁酸菌与2型糖尿病的改善密切相关[2]。另有研究表明1型糖尿病患者粪便中产丁酸菌数量减少[3]。已有大量研究表明日粮中添加丁酸钠可以改善动物的肠道菌群结构[4-6]。因此，本项目研究了在日粮中添加丁酸钠对1型糖尿病模型小鼠血糖、血清胰岛素水平和肠道菌群的影响，以评估该方法对1型糖尿病的治疗效果及可能机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明种雄性小鼠，体质量18～22g，由安徽医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：皖医实动准第01号。小鼠饲养在23℃有空调的房内，自然光照，自由采食和饮水。

1.2 药品与试剂

链脲佐菌素(上海麦克林生化科技有限公司)；丁酸钠(纯度99%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；BBL琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司)；叠氮钠—结晶紫—七叶苷琼脂(北京华威锐科化工有限公司)；胰月示—亚硫酸盐—环丝氨酸琼脂基础和环丝氨酸、MRS琼脂(广东环凯微生物科技有限公司)；小鼠胰岛素ELISA试剂盒(北京安迪华泰科技有限公司)、医用血糖测试纸(三诺生物传感股份有限公司)。

1.3 主要仪器

三诺血糖测试仪(三诺生物传感股份有限公司)；FA1204 B型电子分析天平(上海越平科学仪器有限公司)；JW-3021HR型高速台式冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；DGT-G250型电热恒温鼓风干燥箱、SPT-P250C型智能生化培养箱(合肥华德利科学器材有限公司)；SW-CJ-2D型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)；Synergy H1多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；XK-97A型菌落计数器(杭州齐威仪器有限公司)。

1.4 分组与给药

参照文献[7]方法，造模前将小鼠禁食12h，然后腹腔注射200mg/kg链脲佐菌素[链脲佐菌素溶解在预冷的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH4.2～4.5)中，配制成2%溶液，经0.22μm滤菌器过滤除菌，避光保存，现配现用，在30min内注射完毕]。注射后小鼠自由摄食及饮水，期间观察造模小鼠的饮水量、摄食量、排尿量等情况。5d后，小鼠尾静脉采血并使用血糖仪检测空腹血糖浓度，血糖浓度大于11.1mmol/dL的小鼠认定为糖尿病造模成功。将造模成功的20只小鼠随机分为糖尿病模型组和糖尿病模型+丁酸钠组，每组10只。另设同批购买的10只小鼠为正常对照组。对照组、糖尿病模型组小鼠饲喂正常小鼠日粮。糖尿病模型+丁酸钠组小鼠在日粮中添加3%丁酸钠。实验持续7周。

1.5 指标测定

1.5.1 血糖和胰岛素水平测定

实验结束时小鼠禁食12h后摘除眼球法采血。采出的全血立即用医用血糖测试纸和三诺血糖测试仪测定血糖水平。其余全血凝固析出血清后，3 000r/min离心5min分离血清，置于-70℃冰箱中保存，用小鼠胰岛素ELISA试剂盒测定胰岛素含量。

1.5.2 盲肠内容物中肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌、双歧杆菌和乳酸菌数量测定

采完血后颈椎脱臼处死小鼠，剖开腹腔，无菌采集盲肠内容物用于培养肠道细菌。肠道细菌培养计数的具体操作：无菌取盲肠内容物0.1g，加入0.9mL无菌生理盐水，用移液器吸吹混匀后用无菌生理盐水连续10倍稀释至10-9。每次稀释不同浓度时更换吸头，稀释时吸头不要碰到试管及试管内的液体。分别选择合适的稀释度对肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌、双歧杆菌和乳酸菌用各自的选择性培养基(分别为伊红美蓝琼脂培养基、叠氮钠—结晶紫—七叶苷琼脂、胰月示—亚硫酸盐—环丝氨酸琼脂培养基、BBL琼脂培养基和MRS培养基)进行培养计数。其中双歧杆菌和产气荚膜梭菌采用平板夹心法厌氧培养[8]，其它细菌采用需氧培养。肠杆菌和产气荚膜梭菌37℃培养24h，其他菌37℃培养48h。培养结束后用细菌计数器进行细菌计数，最终以每克盲肠内容物中细菌个数的对数 lg(CFU/g) 表示。

1.6 统计学方法

用DPS数据处理系统对所测数据进行单因素方差分析，并用Ducan's进行多重比较。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 丁酸钠对1型糖尿病模型小鼠血糖和血清胰岛素水平的影响

各组血糖和血清胰岛素水平测定结果见图1。从图1可见，与对照组相比，糖尿病模型组小鼠的血糖水平极显著升高(P<0.01)，血清胰岛素水平极显著低于对照组(P<0.01)，说明模型制作和维持成功。糖尿病模型+丁酸钠组血糖水平极显著高于对照组(P<0.01)，胰岛素水平显著降低低于对照组(P<0.05)，但血糖水平极显著低于糖尿病模型组(P<0.01)，血清胰岛素水平极显著高于糖尿病模型组(P<0.01)。说明日粮中添加丁酸钠对治疗糖尿病有一定作用，但尚不能完全恢复到正常状态。

2.2 丁酸钠对糖尿病模型小鼠盲肠内容物肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌、双歧杆菌和乳酸菌数量的影响

从图2可见，糖尿病模型组双歧杆菌和乳酸菌数量均显著低于对照组(P<0.05)，肠杆菌和肠球菌数量极显著高于对照组(P<0.01)，产气荚膜梭菌数量显著高于对照组(P<0.05)。说明糖尿病模型小鼠肠道菌群组成发生了异常，有益菌数量减少，有害菌数量增加。与模型组相比，丁酸钠能显著增加盲肠中乳酸菌(P<0.05)、双歧杆菌数量(P<0.05)，降低盲肠中肠杆菌(P<0.01)、产气荚膜梭菌数量(P<0.05)，对盲肠中肠球菌有降低趋势(P>0.05)。说明丁酸钠对糖尿病模型小鼠的肠道菌群组成有一定的恢复作用，但同样未能恢复到正常状态。

A：肠杆菌 B：肠球菌 C：产气荚膜梭菌 D：双歧杆菌 E：乳酸菌

3 讨 论

研究表明一次性大剂量注射或连续多次小剂量注射链脲佐菌素时，由于链脲佐菌素直接引起胰岛β细胞的广泛破坏，可造成1型糖尿病动物模型[9]；而注射较少量链脲佐菌素，同时在造模前就开始给予高热量饲料喂养，可诱导出2型糖尿病动物模型[10]。本研究采用大剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素，采用常规日粮饲喂，因此制备的模型属于1型糖尿病模型。从实验结果看，模型组小鼠血糖显著升高，胰岛素水平显著降低，并且表现出多饮多尿的临床症状，符合1型糖尿病的特点，说明模型制备非常成功。

虽然目前普遍认为1 型糖尿病是一种多基因遗传缺陷相关的代谢紊乱疾病，但有研究表明同卵双胞胎共同患病的机率只有约 50%[11]，说明有已知的和未知的环境因素对该病的触发起重要作用。不良饮食习惯可能是触发糖尿病发生的重要环境因素之一。而肠道菌群可能是连接饮食触发糖尿病的桥梁。饮食对肠道菌群组成有非常强烈的影响。肠道菌群不仅影响机体的能量代谢，也影响机体的免疫系统特别是肠道免疫系统的发育和成熟[12-13]。近年来的研究发现，肠道菌群紊乱可能通过改变肠壁通透性及机体免疫功能参与了1型糖尿病的发展进程[14]。关于1型糖尿病时肠道菌群的变化，目前报道尚不一致。Murri等[15]采用PCR-DGGE和荧光定量PCR法发现在属水平上，1型糖尿病儿童中梭菌属、拟杆菌属和韦荣球菌属的数量显著增加，乳杆菌属、双歧杆菌属、Blautia coccoides/Eubacterium rectale 和普雷沃氏菌属的数量显著降低。齐翠娟[16]通过对粪便细菌16S rDNA V3-V4区扩增和高通量测序，发现1型糖尿病儿童肠道菌群中在属水平上，嗜血杆菌属、毛螺菌属、小类杆菌属和氨基酸球菌属、Defluviitaleaceae科下的未分类属的丰度显著降低，而Blautia属的丰度显著升高。徐灵筠[17]用粪便细菌16S rDNA V3区-DGGE法研究了健康小鼠、链脲佐菌素致1型糖尿病模型小鼠和模型未成功小鼠肠道菌群的区别，发现罗伊氏乳杆菌和肠乳杆菌的数量下降与发生糖尿病有关。任晓燕[18]采用荧光定量PCR法比较1型糖尿病儿童和健康儿童粪便中5个菌属(大肠杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属)的差异，发现1型糖尿病儿童双歧杆菌属数量显著减少；大肠杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、拟杆菌属的数量没有显著变化。朱华等[19]给大鼠连续5d腹腔注射链脲佐菌素[剂量为30mg/(kg·BW)]制备1型糖尿病模型，通过粪便细菌16S rDNA-V3区测序技术，发现造模4周时，模型组乳杆菌属相对丰度显著降低、拟杆菌属相对丰度显著增高；造模12周，模型组乳杆菌属、瘤胃球菌属、拟杆菌属相对丰度显著增高，双歧杆菌属相对丰度显著降低。本研究发现糖尿病模型组双歧杆菌和乳酸菌数量均显著低于对照组，肠杆菌和肠球菌数量极显著高于对照组，产气荚膜梭菌数量显著高于对照组。上述这些差异可能与采用的实验对象、研究方法不同有关。但比较一致的结果是多数研究表明1型糖尿病发病后会降低肠道中有益菌(如乳杆菌和双歧杆菌)的数量。

虽然1型糖尿病 患者显示肠道微生态失衡，但目前还不清楚这是触发1型糖尿病的原因还是1型糖尿病所导致的结果[20]。本研究中，采用腹腔注射链脲佐菌素破坏胰岛快速引起糖尿病，与自然发病过程慢慢发展而成的糖尿病相比，其对肠道菌群的影响可能会存在一些差异。虽然在自然发生的糖尿病和药物引起的糖尿病中，糖尿病与肠道菌群之间的因果关系可能存在差异，但在两种不同因素导致的糖尿病发展一段时间后，两者的肠道菌群组成可能会出现趋同。这是因为糖尿病也会对肠道菌群产生影响。一方面，糖尿病患者饮食量增加，从而通过增加营养物质摄入量影响肠道菌群的组成；另一方面，糖尿病时的高血糖会降低肠上皮细胞的胞外谷胱苷肽水平，上调一氧化氮合成酶的表达水平，导致肠道环境的氧化应激水平上升，这将会给肠道菌群的定植产生压力，导致乳杆菌数量显著减少[17]。

丁酸是肠粘膜上皮细胞的首要能量来源，是维持肠道内环境稳定、调节基因表达及调节肠道炎症反应的主要成分[21]。表达转录因子Foxp3的调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)在限制肠道炎症反应中起关键作用[22]。丁酸能调节结肠Treg细胞池的大小和功能，从而减轻肠道炎症[23]。丁酸钠可以预防和治疗饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗(即2型糖尿病)，其机制与促进能量消耗和改善线粒体功能有关[24]。Tian等[25]研究发现饲料中添加丁酸钠可以使草鱼肠道内大肠杆菌数量明显下降，而乳酸杆菌数量显著增加，从而改善了肠道菌群组成。本研究也发现添加丁酸钠可以增加1型糖尿病模型小鼠肠道乳酸菌和双歧杆菌数量，减少有害菌数量。有较多研究表明服用短乳杆菌、乳酸菌、双歧杆菌等益生菌可以改善1型糖尿病[26]。说明通过日粮添加丁酸钠可以弥补1型糖尿病模型肠道中产丁酸菌减少的不良后果，并通过改善肠道菌群结构和降低肠道炎症反应等途径缓解1型糖尿病的病情。

4 结 论

链脲佐菌素诱导的1型糖尿病模型小鼠肠道菌群组成会发生紊乱，表现为有益菌数量减少，有害菌数量增多。丁酸钠对1型糖尿病有一定的治疗作用，其机制是否与改善肠道菌群组成有关需要进一步研究。今后有必要对丁酸钠的适宜剂量、包被后的使用效果进行研究，以便为将其用于1型糖尿病患者的辅助治疗和保健提供实验依据。