行气活血祛湿方对非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的影响*

郑佳连 卢秉久

辽宁中医大学附属医院感染科 (沈阳 辽宁， 110032)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是多种原因导致的以甘油三酯为主要成分的脂质在肝细胞内过量沉积为主要表现的代谢性肝病，根据病理表现分为单纯性脂肪性肝病(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、原发性肝癌(HCC)[1-3]。其中NASH为NAFLD的关键病理阶段，如果不予以治疗，NASH有可能进展为肝硬化甚至是原发性肝癌，故NASH阶段的治疗尤显重要[4]。王文彦教授为全国首批500位名老中医，擅长运用行气活血祛湿法治疗NAFLD，临床效果甚佳。本实验旨在研究行气活血祛湿方对NASH小鼠模型的疗效并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 50只7周龄健康雄性C57Bl/6J小鼠，购自辽宁长生生物技术有限公司，饲养于辽宁中医药大学实验动物中心。

1.2 实验药品及药品制备 行气活血祛湿法方：山楂、荷叶各10 g，红曲6 g，车前子20 g，大腹皮15 g，所有中药购自辽宁中医药大学附属医院中药局。制备方法：将各种药物混合浸泡1 h，第1次加入8倍量水煎煮1 h，第2次加入6倍量水煎煮1 h，合并2次煎煮液，制成浓度为含生药1.5 g/ml和0.3 g/ml两个浓度，于4 ℃冰箱保存备用。水飞蓟宾胶囊(水林佳，天津天士力制药股份有限公司，批号：550707002)。

1.3 主要试剂 试剂盒：ALT、AST、TG、TC比色法试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Trizol购自Invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒、逆转录试剂盒、DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 模型建立 所有小鼠适应性饲养1周后，随机分为5组：对照组、模型组、中药低剂量组、中药高剂量组以及水林佳组，每组10只。对照组小鼠给予胆碱充足高脂饲料(CSHF diet)喂养；其余4组给予胆碱缺乏高脂饲料(CDHF diet)喂养建立NASH模型[5]，共8周。CSHF饲料以及CDHF饲料均购自江苏美迪森公司，成分及热量见表1。

表1 不同饲料成分及热量情况

1.4.2 给药方法 建立模型同时给予药物干预，共8周。给药剂量按实验动物与60 kg成人体表面积比等剂量核算，以该1倍剂量(12.3 mg生药/g体质量)作为低剂量，5倍(61.5 mg生药/g体质量)作为高剂量，进行灌胃给药；水林佳组给予水林佳含量按照0.065 mg/g体质量灌胃给药；对照组及模型组均给予等量生理盐水灌胃。

1.4.3 标本收集与方法 实验8周末全部小鼠称重后麻醉取材，取材前，禁食、禁水12 h，麻醉采用腹腔注射1%苯巴比妥。麻醉后打开腹腔，暴露腹主动脉，无菌注射器抽取腹主动脉血约1 ml，3 000 r/min离心30 min后分离血清，保存待检。迅速分离肝脏，称肝脏湿重，观察大致形态及表面光泽，肝右叶边缘1 cm处取小块肝组织，一部分浸入4%甲醛溶液中，固定以备HE和Sirius red染色；另一部分组织迅速放入-80℃冰箱待检测。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 一般情况 包括小鼠状态、毛发光泽及死亡情况。

1.5.2 体质量及肝脏湿质量 造模结束后，称量小鼠体质量，麻醉取肝脏，称量肝脏质量，计算肝脏质量/体质量。

1.5.3 血清学指标检测 检测血清ALT、AST、TG、TC,按照试剂盒说明书步骤操作，采用手工比色法检测。

1.5.4 肝脏病理学检查 肝组织病理切片按脱水、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等步骤制备，进行HE以及Sirius red染色，最后光镜下观察。

1.5.5 肝组织中TNF-α、α-SMA、IL-6、TGF-βImRNA以及蛋白表达水平 采用RT-PCR法检测肝组织中TNF-α、α-SMA、IL-6、TGF-β1表达水平，引物序列见表2；Western Blot方法检测肝组织中(STING)、TANK结合激酶(TBK1)、干扰素调节因子3(IRF3)的表达水平。

表2 各检测指标的引物序列

2 结果

2.1 一般情况 模型组小鼠易激惹，皮毛油腻；对照组小鼠无明显异常；与模型组相比，各干预组小鼠一般情况不同程度改善。实验过程无实验动物死亡。

2.2 各组小鼠体质量及肝脏湿质量的变化 见表3。与对照组相比，模型组小鼠肝脏湿质量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，中药高剂量组小鼠肝脏湿质量显著下降(P<0.05)。

表3 各组小鼠体质量、肝脏湿重情况比较

2.3 各组小鼠肝功能、血脂的变化 见表4。

表4 各组小鼠肝功能、血脂比较

2.4 各组小鼠肝组织病理的变化 对照组小鼠肝组织HE染色高倍镜下可见肝板结构正常，肝细胞排列规整，中央静脉大小正常，核膜完整，核仁清晰可见；模型组小鼠肝组织可见肝细胞脂肪变，胞浆内可见弥漫分布的脂肪空泡，并可见大量的炎性细胞浸润，证实NASH模型成立；各干预组小鼠可见肝组织形态、结构有不同程度改善，其中中药高剂量组改善最为明显，脂肪空泡明显减少，肝细胞大小接近正常，形态、结构较清晰，可见非常少量的炎性细胞；低剂量组以及水林佳组仍可见到脂肪空泡，肝细胞排列欠规则，仍有炎性细胞浸润(见插页彩图1A)。Sirius red染色中可见模型组肝组织中央静脉附近有大量纤维化沉积；各干预组肝组织纤维组织沉积有不同程度改善，其中高剂量组改善最为明显(见插页彩图1B)。

2.5 各组小鼠肝组织炎症、纤维化相关因子mRNA表达的变化 与对照组相比，模型组小鼠肝脏TGF-β，TNF-α以及α-SMA mRNA表达明显升高；与模型组相比，各干预组小鼠TGF-β，TNF-α以及α-SMA的mRNA表达有不同程度下调，其中高剂量组改善最为显著(P<0.01)，见图2-4。与对照组相比，模型组小鼠肝脏IL-6 mRNA表达明显上升，与模型组相比，各干预组小鼠IL-6的mRNA表达不同程度下调，其中高剂量组改善最为显著(P<0.01)，见图5。

图2 TGF-β mRNA表达

图3 TNF-α mRNA表达

图4 αSMA mRNA表达

图5 IL-6 mRNA表达与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，# P<0.05,##P<0.01

2.6 各组小鼠肝组织STING-IRF3信号转导通路的变化 STING-IRF3信号转导通路由STING、TBK1、IRF3组成。与对照组相比，模型组小鼠肝组织中STING、TBK1、IRF3蛋白表达明显上调(P<0.01)；各干预组小鼠肝组织STING、TBK1、IRF3蛋白表达均有不同程度下调(P<0.01，P<0.05)，其中中药高剂量组改善最为显著(P<0.01)。见表5、图6。

表5 各组小鼠肝脏组织STING-IRF3蛋白表达水平比较

1.对照组 2.模型组 3.中药低剂量组 4.中药高剂量组 5.水林佳组图6 各组小鼠肝脏组织STING、TBK1、IRF3蛋白表达电泳图

3 讨论

王文彦老中医认为NAFLD早期的病机为气滞湿阻，中、晚期病机为气滞湿阻血瘀，故立行气活血祛湿法为核心大法。在临床中证实行气活血祛湿方治疗NASH取得了很好的疗效，方中山楂、红曲二者色赤入血，化血中之瘀。现代饮食不节已经成为脂肪肝的最主要病因，多食精谷细粮、鱼脍酒肉，加之多坐少动，精微物质摄入过多却无以消耗，在体内化湿生痰。如若脾胃强健，则水谷即食即化气血，无以化为痰湿，山楂、红曲二味妙用即在此：除活血功用外，同时均具有消食化积之功效，山楂善消肉食，红曲善消米面，间接起到祛湿化痰的目的。荷叶质轻主升，消暑利湿；车前子主降，祛湿利水。大腹皮行气理气兼祛湿利水。五药合用共奏行气活血祛湿之功效。先期研究过程中，我们利用纯化高脂饲料建立小鼠NASH模型，行气活血祛湿方能够降低模型小鼠肝脏中炎症反应并改善NASH病理。[6-8]

胆碱作为一类重要维生素，参与了细胞膜以及脂蛋白构成过程。缺乏胆碱会导致肝脏向外周运输甘油三酯障碍，即模拟了非酒精性脂肪性肝病的病理过程[9，10]。先前大量研究已成功利用CDHF饲料建立NASH模型。本次实验同样采用该方法建立小鼠NASH模型。实验结果与之前研究结果相同，CDHF饲料饲养8周即可建立NASH模型，且具有死亡率低的优点，值得推广。

STING是一种内质网膜蛋白[11],先期大量关于STING的研究均与病原体感染相关[12]，当机体被病原体感染后,病原体的DNA进入到宿主细胞的胞浆中。胞浆中的传感器(cGAS酶),分解DNA合成环状二核苷酸(cGAMP)并激活内质网膜上的STING，激活后的STING移动到细胞核周围并招募细胞质中的TBK1及其下游因子IRF3,引起IRF3磷酸化[13，14]。进入细胞核的IRF3与目的基因启动子结合,促进NF-κb、TNF-a、IL-6等炎症因子的表达,引起肝脏炎症反应[15]。2013年,Petrasek等[16]报道称,STING-IRF3通过将内质网应激与肝细胞凋亡信号联系起来介导酒精性脂肪肝的发生。NAFLD与酒精性脂肪性肝病的病理学过程存在相似之处,然而其在NAFLD发生发展过程中的作用研究较少。国内的研究表明[17，18]，高脂饮食及游离脂肪酸能够激活肝细胞中STING-IRF3信号通路,导致肝细胞炎症及凋亡,同时该通路还直接或间接地影响肝细胞的糖脂代谢。该通路表达缺陷能够改善高脂饮食引起的脂肪组织炎症、代谢紊乱及胰岛素抵抗,这表明STING-IRF3信号通路通过诱导炎症、凋亡及促进糖脂代谢紊乱导致肝细胞损伤。先前的研究表明行气活血祛湿方可通过抑制肝脏炎症反应改善NASH,STING-IRF3信号转导通路为众多炎症因子的上游调控通路，我们猜测行气活血祛湿方的炎症抑制作用是通过调控STING-IRF3信号转导通路实现的，故进行本次研究予以证实。

实验结果表明，各干预组小鼠肝功能以及病理、血脂、炎症因子以及纤维化相关因子的mRNA表达、STING-IRF3信号转导通路蛋白均得到改善，其中中药高剂量组效果最为显著。印证了之前研究的结论：NASH情况下，STING-IRF3信号转导通路被激活，并导致下游TNF-α、IL-6等炎症因子的激活进一步加重肝脏炎症反应。

NASH在肝脏病理上的表现以炎症和纤维化为显著特点。前期的研究表明行气活血祛湿方可以抑制炎症因子的表达，本次的研究结果表明该方对IL-6、TNF-α等炎症因子上游STING-IRF3通路同样有调控作用。除此以外，本次研究观察该方对纤维化相关因子TGF-β、TNF-α以及α-SMA表达的影响，并通过Sirius red染色证实对NASH肝组织中纤维化沉积的影响。结果表明该方可抑制TGF-β、TNF-α以及α-SMA的表达，并减少NASH肝脏中纤维化沉积。以中药高剂量组疗效改善最为明显。