补肾解毒法对HBV感染免疫耐受期产妇脐带血浆细胞样树突状细胞中PI3K、mTOR、p70S6K、IFN-α表达的影响*

彭建平 杨雯珺 霍 燚

1.湖南中医药大学第一附属医院肝病科 (长沙， 410007) 2.湖南中医药大学

HBV是嗜肝细胞病毒，感染人体早期能躲避机体先天免疫系统，能负向调节机体免疫功能，HBV不直接损伤肝细胞，而由免疫清除介导的炎症反应损伤机体[1-3]。多数患者因肝脏慢性炎症反应导致肝脏慢性纤维化，逐渐发展为肝硬化、肝癌，因诸多严重并发症而死亡，慢性HBV感染者也面临乙型肝炎重症化、肝细胞型肝癌的风险。当前认为慢性HBV感染者难以彻底清除HBV病毒，主要原因为稳定的cccDNA持续存在及机体免疫功能受损[1-4]。许多研究提示，HBV感染者机体免疫功能受损，不能有效清除HBV[1,2,5,6]。因此恢复机体免疫功能对治疗HBV感染有重要意义。浆细胞样树突状细胞(pDCs)是机体重要的免疫细胞，能产生体内95%左右的Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)抗病毒，能激活NK细胞溶解被感染的细胞，并能提呈抗原激活特异性免疫系统，在抗病毒中起着重要作用[2,7,8]。目前主要认为干扰素通过降解cccDNA、病毒mRNA，抑制病毒DNA及增强宿主对被感染的肝细胞的免疫反应，清除病毒[3]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-p70核糖体S6蛋白激酶(p70S6k)是一条重要的细胞通路，参与许多重要的细胞生理功能，该途径的异常能导致恶性肿瘤、代谢性疾病、病毒感染不能清除等[9-12]。Cao等[13]研究发现，pDC产生干扰素-(IFN-α)过程需要PI3K、mTOR、p70S6k的参与。我们前期研究发现HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k mRNA、蛋白表达及IFN-α分泌较正常产妇明显减少，可能是HBV感染者pDCs产生IFN减少导致HBV感染缠绵难愈的原因之一。本实验观察补肾解毒法对HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k及IFN-α表达的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 湖南中医药大学第一附属医院2017年8月至2020年1月产科住院部乙型肝炎免疫耐受期产妇10例，其诊断标准参见《2015年慢性乙型肝炎诊治指南》[14]。排除条件：①合并其他肝病；②合并肝硬化、肝癌等；③合并其他严重心肺肾脑疾病；④近半年内有合并细菌感染及其他病毒感染证据；⑤合并免疫系统疾病或近半年内接受免疫治疗者。本研究方案经由湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会审批(批号：AF/SC-07/02.0)。

1.2 实验材料

1.2.1 实验动物 20只SD大鼠，雌雄各10只，体质量140～160 g，SPF级，由湖南中医药大学动物实验室提供，动物合格证号1107272011001140。

1.2.2 主要药物 本实验的补肾方为六味地黄丸，源自《小儿药证直诀》，组成：熟地黄、山茱萸、山药各12 g，泽泻、茯苓、丹皮各9 g。解毒方为甘露消毒丹，源自《温热经纬》，组成：白蔻仁、石菖蒲、黄芩、连翘 、贝母、射干、藿香各 10 g，茵陈 15 g，滑石 30 g，薄荷 6 g。补肾解毒方由两方相加。所有药材均使用地道药材，并通过医院药学专家的质量鉴定。

1.2.3 主要试剂 淋巴细胞分离液(天津灏洋公司)，PBS、RPMI-1640(Thermo公司)，Recombinant Human IL-3、Flt3-L(peprotech，catalog#:200-03、300-19)，BDCA-2-PE、CD123-FITC、BDA-4-APC及同型对照抗体(德国Miltenyi Biotec公司)，CpG ODN2216(5’-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3’，上海生物工程有限公司)，Trizol(ambion，15596026)，SYBR Green PCR试剂盒(KAPA Biosystems，KM4101)，逆转录试剂盒(TAKARA，639505)，DNaseⅠ(Fermentas，AM2295)，DEPC处理水(bioswamp,RN1680)，引物由武汉天一辉远有限公司合成，人IFN-α ELISA试剂盒(Bioswamp,HM10251)等。

1.2.4 主要器材 电泳仪(BIO-RAD，型号：mini protean 3 cell),酶标仪(芬兰 雷勃，MK3),干式恒温器(杭州爽盛仪器，K30)，离心机(德国Eppendorf，Centrifuge5424R),微量移液枪(美国Rainin PiPet-Lite，各种型号)，水浴锅(Leica，HI1210)，冰箱(中国 Haier，BCD-196TMZL),全自动化学发光分析仪(上海 天能，Tanon-5200),超净工作台(苏州 净化，SW-CJ-1D型)，PCR仪(杭州 柏恒，GE48527)，荧光定量PCR仪(Bio-Rad,CEX-Connect96),凝胶成像系统(北京 君意，JY045-3C),37℃恒温培养箱(上海 一恒，LRH-150)等。

1.3 实验方法

1.3.1 脐带血pDCs的培养 免疫耐受期乙型肝炎产妇脐带血pDCs的具体培养与鉴定过程参考此前建立的实验方法[15]。

1.3.2 含药血浆的制备 20只SD大鼠适应性喂养1周，随机分成4组，无药物血浆组、补肾组、解毒组、补肾解毒组，药物的制备及灌胃参考文献要求及前期实验[16,17]。前期实验发现使pDCs生存率最高的血浆浓度分别为10%补肾中剂量组、10%解毒小剂量组、10%补肾解毒中剂量组[1]。本实验制备补肾中剂量、解毒小剂量、补肾解毒中剂量的含药血浆，按照人-动物体表面积换算法计算，小剂量相当于成人临床用药的6.562倍，以小剂量的5倍剂量为中剂量，灌胃大鼠，每次1 ml，连续灌胃3 d，末次给药2 h后采血，离心，过滤细菌，分装至EP管，存放于-20℃冰箱保存备用。

1.3.3 含药血浆干预 含药血浆干预参考文献要求及前期实验[16,17]。将培养至第7天的pDCs用含终浓度为2 μg/ml CpG ODN 2216 的完全培养基换液并调细胞浓度至2×105/ml，按照每孔90 μl铺至96孔培养板中，分5组干预，补肾组加入10 μl补肾中剂量药物血浆，解毒组加入10 μl解毒小剂量药物血浆，补肾解毒组加入10 μl补肾解毒中剂量药物血浆，无药物血浆组加入10 μl无药物血浆，空白组添加10 μl完全培养基，置于37℃饱和湿度、5%CO2培养箱内培养48 h后，分别收集细胞及上清液，标记，后续进行相应的mRNA、蛋白及IFN-α检测。

1.3.4 各组pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k mRNA的相对定量检测 引物序列见表1。使用Trizol提取细胞中总RNA，经DNase I消除RNA中的DNA，去除DNase I，使用Oligo(dT)按逆转录试剂盒要求反转录出cDNA，在各样本cDNA中加入相应引物、SYBR Green Mix、DNA聚合酶、ddH2O等配制扩增体系，进行PCR扩增，每个样本重复测量3次，根据软件记录的PCR扩增过程的荧光信号，得到相应的CT值，用2-△△CT公式计算得到目的基因的相对定量。

表1 引物序列表

1.3.5 各组pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k 蛋白的检测 配制Western Blot实验所需的溶液，制备分离胶及浓缩胶，用梳子制作上样孔。用PBS洗涤细胞，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液裂解细胞，将被裂解的细胞转至EP管，加热变性蛋白，离心备用。使用BCA试剂测量各样本蛋白浓度。将蛋白及BCA试剂分别加入相应上样孔，在电泳液中电离，当染料到达电泳胶底部时停止电泳，用电转液电转膜，5%脱脂奶粉室温2 h封闭蛋白膜，用加入PI3K、mTOR、p70S6K抗体室温孵育1 h，加入HRP标记得羊抗鼠IgG室温孵育1h，PBST洗涤3次，在暗室用ECL发光液对蛋白膜进行显色，用仪器读取蛋白条带灰度值。

1.3.6 各组上清液中IFN-α的检测 将各组细胞的上清液，按照ELISA试剂盒说明书步骤进行检测，以OD值为横坐标，IFN-α为纵坐标，求出方程，再根据每个OD值计算出相应的IFN-α浓度，乘相应的稀释倍数得到每个样本的INF-浓度值。

2 结果

2.1 各组样本pDCs中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA表达情况见表2

表2 各组间HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs PI3K、mTOR、p70S6K mRNA表达的比较

2.2 各组样本pDCs中PI3K、mTOR、p70S6K 蛋白表达情况 见图1、表3

图1 各组标本 PI3K、mTOR、p70S6K 蛋白表达图

表3 各组间HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs PI3K、mTOR、p70S6K 蛋白表达及IFN-α 的比较

3 讨论

彭得倜等[18]研究发现补肾解毒方能降低慢性HBV感染免疫耐受期患者的HBVDNA、HBeAg、HBsAg定量，并能提高机体免疫功能。我们研究发现补肾解毒法能促使HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs中Toll样受体9、干扰素调节因子7的表达及IFN-α分泌增加[1]。以上提示补肾解毒法能提高HBV感染者机体免疫功能。我们前期研究发现HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k mRNA、蛋白表达及IFN-分泌较正常产妇明显减少，可能是HBV感染者pDCs产生IFN减少导致HBV感染缠绵难愈的原因之一。补肾解毒法对HBV感染者pDCs PI3K、mTOR、p70S6k有何影响，目前国内外少有研究。

HBV属疫毒，根据HBV感染后发展过程的临床表现，对应中医的“胁痛”“黄疸”“积聚”“臌胀”等疾病。内经有言，“正气存内，邪不可干” “邪之所凑，其气必虚”，人体正气充足时，不易感染邪气，即使被感染，也能及时清除病邪，邪毒久留不去，因兼有正气不足，治疗当不忘扶正。慢性乙型肝炎患者多为婴幼儿期感染，此期人体形气未充，正气不足，或不能识别病毒，病毒潜伏缠绵不愈，损伤正气，正虚无力驱邪外出，由此相互损益。正气源于脾肾。疫毒内客，化湿生热，日久损及脾胃，水湿运化失常，加重湿邪困阻，湿滞气郁血瘀可化热。治以扶正驱邪，补肾解毒。

本实验选用六味地黄丸合甘露消毒丹加减组成补肾解毒方。方中熟地黄填精益髓，滋补肾精，山茱萸补养肝肾，山药补脾益肾，佐以泽泻利湿泄浊，牡丹皮清泻相火，茯苓健脾渗湿，滑石清热利湿，茵陈清利湿热退黄，黄芩清热燥湿解毒，白蔻仁、石菖蒲、藿香行气化湿，健脾和中，令气畅湿行，连翘、薄荷、射干、贝母清热解毒，透邪散结，共奏益肾健脾、利湿化浊、清热解毒之功。

本实验以HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs为研究对象，用补肾方及补肾解毒方含药血浆干预后，PI3K、mTOR、p70S6k mRNA及蛋白表达增加，IFN-α升高，其中补肾解毒方的影响更明显，表明补肾方及补肾解毒方能促进HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k mRNA及蛋白表达及IFN-α分泌，改善机体免疫功能，补肾解毒方效果优于补肾方。

综上所述，补肾解毒方能促进HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs中PI3K、mTOR、p70S6k mRNA及蛋白表达及IFN-α分泌，为临床单用补肾解毒法或与IFN-α、核苷类似物联用，通过免疫调节治疗HBV感染者，提供了部分理论依据，同时也为进一步研究HBV感染者pDCs的PI3K、mTOR、p70S6k等相关内容，如研究IFN-α增效减毒的中医辅助疗法，提供了部分参考。