蛇伤外敷超微散质量标准的研究

★ 刘水婷 朱卫丰* 李佳莉 沈安 王万春（.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004；.江西中医药大学附属医院外一科 南昌 330006）

中医治疗毒蛇咬伤常采用中药外敷，中药外敷能够直接作用于病所，达到解毒、消肿、止痛的作用［1］。蛇伤外敷散（由七叶一枝花、半边莲、枯矾、芒硝、黄柏、制天南星、白芷、川芎、五灵脂等药材组成）是江西中医药大学附属医院的经验方。具有解毒化瘀、消肿止痛的功效，临床上用于辅助治疗蛇毒咬伤所致的“风、火二毒”［2］。经多年临床证实，此经验方疗效显著，但在临床使用中患者反映散剂颗粒粗大，且具有灼烧感，于是临床提出对剂型进行改良，研制出蛇伤外敷超微散剂。为了更全面地对蛇伤外敷超微散剂内在质量进行控制，本研究采用薄层色谱法、显微鉴别法等对处方中相关药物进行定性鉴别，同时采用HPLC法测定制剂中黄柏的有效成分盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的含量。以期为该方质量标准的制定提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 EPED实验室级超纯水器（南京易普易达科技发展有限公司）；KQ-500VDE数控超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；Agilent1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；紫外分光光度计（上海精科实业有限公司）；BP211D Sartorius 电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；振动式药物超微粉碎机（WZJ-6BI型 济南天宇专用设备有限公司）；西厨多功能粉碎机（800Y型 永康市铂欧五金制品有限公司）；药典筛三号筛（浙江上虞市道墟张兴纱筛厂）；真空干燥箱（OZF-6050型 上海新苗医疗机械制造有限公司）。

1.2 试药 重楼（产地：四川，批号：161116）；醋炒五灵脂（产地：湖北，批号：161214，）；川芎（产地：四川，批号：170208）；白芷（产地：安徽，批号：161110）；芒硝（批号：170221）；半边莲（产地：江苏，批号：170112）；制天南星（产地：四川，批号：160324），以上均购自江西江中中药饮片有限公司；枯矾（产地：四川，批号：1506062，四川新荷花中药饮片股份有限公司）；黄柏（产地：四川，批号：180801，江西继中堂健康科技有限公司）；盐酸小檗碱对照品（批号：110713-2001212）、盐酸黄柏碱对照品（批号：111895-201504）均购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯；自制蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别［3］

2.1.1 蛇伤外敷超微散中重楼的TLC鉴别 取蛇伤外敷超微散2.0 g，加入乙醇10 mL，加热回流提取30 min，滤过，滤液作为供试品溶液，同法制备阴性对照。另取重楼对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。吸取供试品溶液及对照药材溶液各7 μL及（含量测定）项下对照品溶液5 μL，分别点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15∶5∶1）为展开剂，展开，待晾干后，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热显色，置日光或365 nm紫外灯下检视。结果见图1.1和1.2。

图1.1 日光下重楼薄层色谱图

图1.2 365nm重楼薄层色谱图

2.1.2 蛇伤外敷超微散中川芎的TLC鉴别 取蛇伤外敷超微散5.0 g，加入乙醚20 mL，加热回流提取1 h，滤过，滤液挥干后，加乙酸乙酯2 mL使溶解残渣，作为供试品溶液。同法制备阴性对照。另取川芎对照药材1.0 g，同法制成对照药材溶液。吸取供试品溶液10 μL及对照药材溶液各11 μL，分别点于硅胶GF254薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（3∶1）为展开剂，展开，待晾干后，置紫外光灯（254 nm）下检视。结果见图2。

图2 川芎薄层色谱图

2.1.3 蛇伤外敷超微散中白芷的TLC鉴别 取蛇伤外敷超微散6.0 g，加乙醚提取两次，10 mL/次，合并提取液，挥干乙醚，残渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作为供试品溶液。同法制备阴性对照。 取欧前胡素、异欧前胡素对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。另取白芷对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。吸取供试品溶液，对照药材各6 μL及对照品溶液1 μL，分别点于硅胶G薄层板上，以石油醚-乙醚（1∶1）为展开剂，展开，待晾干后，置紫外光灯（254 nm）下检视。结果见图3。

图3 白芷薄层色谱图

2.1.4 蛇伤外敷超微散中半边莲的TLC鉴别 取蛇伤外敷超微散5.0 g，加氯仿50 mL，超声处理半小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，加甲醇1 mL使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。同法制备阴性对照。另取半边莲对照药材1.0 g ，同法制成对照药材溶液。吸取供试品溶液及对照药材溶液各5 μL，分别点于硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60）-醋酸乙酯（5∶1）为展开剂，展开，待晾干后，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果见图4。

图4 半边莲薄层色谱图

2.1.5 蛇伤外敷超微散中制天南星的TLC鉴别 取蛇伤外敷超微散5.0 g，加乙醇50 mL，加热回流1.5 h，滤过，滤液蒸干，残渣加10 mL乙醚超声处理5 min，滤过，残渣再用乙醚重复处理2次，合并三次乙醚液，蒸干，残渣加甲醇0.5 mL溶解，作为供试品溶液。同法制备阴性对照。另取干姜对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。吸取供试品溶液及对照药材溶液各6 μL，分别点于硅胶G薄层板上，环己烷-乙醚-丙酮-冰醋酸（40∶10∶5∶0.5）为展开剂，展开，晾干后，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果见图5。

图5 制天南星薄层色谱图

2.1.6 蛇伤外敷超微散中黄柏的TLC鉴别 取蛇伤外敷超微散3.0 g，加乙醚40 mL，超声处理15 min，滤过，保留药渣并挥尽乙醚，药渣加入50 mL甲醇，加热回流30 min，滤过、滤液蒸干，残渣加2 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。同法制备阴性对照。取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的对照品溶液。另取黄柏对照药材0.2 g，加甲醇25 mL，加热回流30 min，滤过、滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为对照药材溶液。吸取供试品溶液及对照药材溶液各4 μL，分别点于硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）为展开剂［4］，展开，晾干后，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果见图6。

图6 黄柏薄层色谱图

2.2 显微鉴别 取本品粉末少量，置载玻片上，摊平，加 1 滴水合氯醛，透化处理后，在显微镜下观察，在高倍镜下拍照。

2.2.1 蛇伤外敷超微散中重楼的显微鉴别 草酸钙针晶粗大，成束或散在，长80～250 μm［5］。见图7.1和图7.2。

图7.1 重楼草酸钙大针晶成束（×400）

图7.2 重楼草酸钙大针晶散在（×400）

2.2.2 蛇伤外敷超微散中制天南星的显微鉴别 草酸钙针晶较细，成束，长6～35μm［5］。见图8。

图8 制天南星草酸钙针晶成束（×400）

2.2.3 蛇伤外敷超微散中黄柏的显微鉴别 纤维呈鲜黄色，直径为16～38 μm，常成束，常形成晶纤维。石细胞呈树突状［6］。见图9.1和9.2。

图9.1 黄柏晶纤维图（×400）

图9.2 黄柏树突状石细胞图（×400）

2.2.4 蛇伤外敷超微散中川芎的显微鉴别 多数油室可见破损，偶尔可见油室的碎片，内含油滴较多。见图10。

图10 川芎油滴图（×400）

2.2.5 蛇伤外敷超微散中白芷的显微鉴别 木栓细胞多角形或类长方形，淡黄棕色。内含油管且多已破碎成管状，内含滴状或块状黄棕色分泌物［7］。见图11。

图11 白芷油管图（×400）

2.3 蛇伤外敷超微散粒径 取适量的蛇伤外敷超微散，用马尔文激光粒度仪测其粒径（size），测定三批样品 ，粒径数据见表1和图12。

表1 蛇伤外敷超微散粒径 μm

图12 蛇伤外敷超微散粒径分布图

2.4 蛇伤外敷超微散中黄柏含量测定

2.4.1 黄柏中小檗碱的含量测定

2.4.1.1 色谱条件 色谱条件：菲罗门C18-色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g），流速：1.0 mL/min，检测波长：265 nm，进样5 μL。

2.4.1.2 专属性考察 黄柏中盐酸小檗碱的专属性试验结果见图13。

图13 盐酸小檗碱的HPLC图

2.4.1.3 线性关系考察 对照品溶液的制备：精密称定盐酸小檗碱5 mg，加入至10 mL容量瓶中，用流动相定容。

母液的浓度盐酸小檗碱503.5 μg/mL，依次稀释 至251.75、125.88、62.94、31.47、15.74、7.87 μg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液。将对照品溶液注入液相色谱仪，按“2.4.1.1”项下方法测定峰面积。以对照品浓度（μg/mL）为纵坐标，峰面积分值为横坐标，绘制标准曲线，结果显示小檗碱的线性方程为：Y=9.434 8X+ 44.62，r=0.999 6，盐酸小檗碱在7.87～503.5 μg/mL范围内线性关系良好。

2.4.1.4 精密度考察 精密吸取上述同一对照品溶液5 μL，按“2.4.1.1”项下方法重复进样6次，测定峰面积，计算出浓度，结果盐酸小檗碱的浓度值RSD为0.17%，表明精密度良好。

2.4.1.5 稳定性考察 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样，测定峰面积，计算浓度RSD为0.85%。试验表明24 h内测定结果稳定可靠。

2.4.1.6 重复性考察 按拟定的含量测定方法，对同一批样品，同时取样6份，分别制备供试品溶液，按“2.4.1.1”项下方法测定，计算的浓度RSD为0.73%，重现性良好。

2.4.1.7 加样回收率 取已知含量的样品六份，分别加入同一对照品溶液，混合均匀后，过0.22 μm为微孔滤膜后，按“2.4.1.1”项下方法进样分析，计算回收率。结果见表2。

表2 盐酸小檗碱加样回收率试验结果

2.4.1.8 含量测定 取蛇伤外敷超微散粉末（过三号筛）约1.2 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加流动相80 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz） 40 min，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见表3。

表3 盐酸小檗碱含量测定结果

2.4.2 黄柏中黄柏碱的含量测定

2.4.2.1 色谱条件 色谱条件：菲罗门C18-色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（36∶64）（每100 mL加十二烷基磺酸钠0.2 g）为流动相，流速：1.0 mL/min，检测波长：284 nm，进样5 μL。

2.4.1.2 专属性考察 黄柏中盐酸黄柏碱的专属性试验结果见图14。

图14 盐酸黄柏碱的HPLC图

2.4.2.3 线性关系考察 对照品溶液的制备：精密称定盐酸黄柏碱10 mg，加入至10 mL容量瓶中，用流动相定容。

母液的浓度盐酸黄柏碱503.5μg/mL，依次稀释 至506.5、253.25、126.63、101.3、63.31、31.66、15.83、7.90 μg/mL的盐酸黄柏碱对照品溶液。将对照品溶液注入液相色谱仪，按“2.4.2.1”项下方法测定峰面积。以对照品浓度（μg/mL）为纵坐标，峰面积分值为横坐标，绘制标准曲线，结果显示盐酸黄柏碱的线性方程为：Y=5.456 3X+ 1.453 1，r=0.999 8，盐酸黄柏碱在7.90～1 013 μg/mL范围内线性关系良好。

2.4.2.4 精密度考察 精密吸取上述同一对照品溶液5 μL，按“2.4.2.1”项下方法重复进样6次，测定峰面积，计算出浓度，结果盐酸黄柏碱的浓度值RSD为0.34%，表明精密度良好。

2.4.2.5 稳定性考察 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样，测定峰面积，计算浓度RSD为1.46%。试验表明24 h内测定结果稳定可靠。

2.4.2.6 重复性考察 按拟定的含量测定方法，对同一批样品，同时取样6份，分别制备供试品溶液，按“2.4.2.1”项下方法测定，计算的浓度RSD为0.93%，重现性良好。

2.4.2.7 加样回收率 取已知含量的样品六份，分别加入同一盐酸黄柏碱对照品溶液，混合均匀后，过0.22 μm为微孔滤膜后，按“2.4.2.1”项下方法进样分析，计算回收率。结果见表4。

表4 盐酸黄柏碱回收率结果

2.4.2.8 含量测定 取蛇伤外敷超微散粉末3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相25 mL，称重超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见表5。

表5 盐酸黄柏碱含量测定结果

3 讨论

本研究采用TLC对蛇伤外敷超微散中重楼、半边莲、黄柏等药材进行了鉴定。在黄柏的薄层鉴别中，曾使用过苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨试液（12∶6∶3∶3∶1）作展开剂，但出现拖尾现象，特征斑点不明显。通过多次试验， 筛选出以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）为展开剂［4］，分离效果好，所得斑点清晰明显。采用显微鉴别法对处方中重楼、制天南星等药材进行鉴定，观察的显微结构较为清晰。HPLC法对小檗碱和黄柏碱进行含量测定，多批次的测定结果有较好的重复性。为蛇伤外敷超微散制订相应的质量标准，能为其安全使用提供保障［8］，也为临床研究提供更加可靠的资料，并且可以对未来研究该处方新的剂型、新的工艺等提供参考。