Box-behnken响应面设计优化褪黑素PLGA纳米粒的处方*

★ 颜仁梁 程新梅（1.广东食品药品职业学院 广州 51050；.杭州胡庆余堂药业有限公司 杭州 311100）

褪黑素（melatonin，MT）又名美拉酮宁、松果腺素，由哺乳动物的松果体在夜间合成和分泌的一种胺类激素，其含量随时间节律变化而改变，在人体内含量极少［1］。褪黑素具有广泛的生理活性，如调节昼夜节律和睡眠-觉醒周期、抗氧化、清除自由基、抗炎、抗凋亡等作用［2］。尽管褪黑素的作用受到广泛关注，但由于其水溶性差，半衰期短、生物利用度低而限制了其临床应用［3］。纳米递药系统作为近年来药剂学领域研究的热点，药物与载体材料之间可形成骨架型或核-壳型结构，粒度大小在10～1 000 nm，在提高药物溶解度，改善难溶性药物的生物利用度方面具有重要作用。聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］作为可生物降解的高分子材料，因具有良好的生物相容性、成囊和成膜性能及控制药物缓释的特性，广泛用作纳米给药系统的载体材料［4］。

本实验以褪黑素为模型药物，采用乳化溶剂挥发法制备褪黑素PLGA纳米粒，通过Box-Behnken响应面实验设计优化制备褪黑素PLGA纳米粒的最佳处方。

1 仪器与材料

JY92-2D型超声细胞粉碎机（宁波新芝生物科技有限公司）；EYELA FDU-1200型冻干机（日本东京理化株式会社）；K30型高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；UV-8000A紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）； Nano-S 90型激光粒度分析仪（英国马尔文公司）；JEM-1200EX透射电镜（日本电子公司）。

褪黑素原料药（上海阿拉丁生化科技股份公司，批号：20170923，纯度：98 %）；褪黑素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：520023-2013 01，纯度：99.8 %）；褪黑素（M118674，购自上海阿拉丁试剂有限公司），聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，L:G=50:50，Mw约为55000，济南岱罡生物工程有限公司），聚乙烯醇（PVA，Mw约为13000，Sigma-Aldrich公司）

2 方法与结果

2.1 褪黑素-PLGA 纳米粒的制备 采用乳化溶剂挥发法制备荷载褪黑素的PLGA纳米粒［5］。将PLGA与褪黑素共同溶解于乙酸乙酯中作为有机相，以含有乳化剂PVA水溶液作为水相，在磁力搅拌条件下将油相与水相混合均匀，在冰水浴条件下置探头式超声仪中超声3 min（功率400 W，时间5 min）形成外观均一的乳剂，旋转蒸发以除去残留的有机溶剂，在室温条件下置于磁力搅拌器上搅拌（600 r/min）挥干有机溶剂，即得荷载褪黑素的PLGA纳米粒；同法制备不含褪黑素的PLGA空白纳米粒。将所制备的PLGA纳米粒进行冷冻干燥，样品备用。

2.2 褪黑素含量测定

2.2.1 溶液的制备 称取所制备的褪黑素PLGA纳米粒冻干粉10 mg，置于10 mL容量瓶中加入乙腈，水浴式超声仪中超声10 min，经0.22 μm微孔滤膜滤过后，作为供试品溶液备用；同法制备不含褪黑素的空白PLGA纳米粒作为阴性供试品溶液。取上述两种溶液适量，在200～400 nm范围内进行波长扫描，以确定褪黑素的最大紫外吸收波长。结果表明褪黑素在277 nm处有最大吸收，而空白的PLGA纳米粒供试品溶液在此波长下无吸收。

2.2.2 标准曲线的制备 精密称取褪黑素5 mg，用适量乙腈溶解后配制成浓度为0.5 mg/mL的褪黑素储备溶液备用。取上述储备溶液分别以蒸馏水稀释成浓度为2.5、7.5、15、37.5、75 μg/mL的对照品溶液，于277 nm波长处测定吸光度，以吸光度与褪黑素浓度进行线性回归，所得标准曲线回归方程为：A=0.027 3C-0.031 5，r2=0.999 9，结果表明褪黑素在2.5～75 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 方法学考察 取褪黑素对照品7.5、37.5、75 μg/mL低、中、高3种浓度溶液，分别在1 d内和连续3 d内于277 nm处测定吸光度进行精密度考察，结果3个质量浓度样品的日内和日间RSD 分别为1.79 %、1.68 %、1.32 %和3.87 %、2.51 %、2.15 %（n=5）。稳定性实验结果表明褪黑素在12 h内稳定，RSD为2.72 %（n=5）。按2.1项下方法制备空白PLGA纳米粒，加入低、中、高浓度的褪黑素标准溶液后按供试品溶液处理方法测定褪黑素的含量并计算回收率，其回收率结果分别为97.82 %、99.51 %、100.36 %，RSD为3.27 %、2.15 %和2.68 %（n=5）。上述结果表明该方法可以用于褪黑素PLGA纳米粒的含量测定。

2.3 包封率及载药量的测定 采用超滤离心法进行褪黑素PLGA包封率的测定［6］。精密量取褪黑素PLGA纳米粒混悬剂0.5 mL，置于超滤离心管中（Mw3000）在4 000×g条件下离心15 min，移取下层澄清液，在波长277 nm处测定吸光度A，计算褪黑素的含量，计算未被包封褪黑素的质量，记为W游离；同时精密量取褪黑素PLGA纳米粒0.5 mL置于10 mL容量瓶中，加入乙腈稀释至刻度，超声15 min，精密量取2.0 mL经12 000 ×g离心15 min，取上清液测定其中褪黑素的含量，计算总的褪黑素质量，记为W总，根据所用PLGA的重量WPLGA，分别按下列公式计算包封率（entrapment efficiency，EE）与载药量（drug loading, DL）。

2.4 褪黑素-PLGA纳米粒粒径的测定 精密量取所制备的褪黑素PLGA纳米粒0.2 mL，加入蒸馏水稀释至10 mL，置于马尔文激光粒度测定仪中，进行粒径大小的测定。

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2.5 褪黑素PLGA纳米粒的处方优化

2.5.1 实验设计 采用Box-behnken效应面实验设计优化PLGA纳米粒处方［7-9］。根据前期单因素预试验结果，我们发现当PLGA质量浓度（mg/mL）在0.5 %～5 %范围内时，能够形成PLGA纳米粒，但当乙酸乙酯油相中载体材料PLGA浓度较高时，需要相应地提高乳化剂PVA的浓度才能形成粒径较小的纳米粒；故在本实验中PLGA的浓度设定为0.5 %～3.5 %；根据PLGA的浓度设定模型药物褪黑素与PLGA的比例为5 %～10 %。因此，选择对褪黑素PLGA纳米粒制备影响显著的三个处方因素，即PLGA用量（X1），褪黑素与PLGA的比例（X2）、乳化剂PVA浓度（X3）作为考察指标，以所制备的纳米粒的粒径（Y1，nm）、包封率（Y2，EE%）及载药量（Y3，DL%）为响应值，分别采用三因素三水平的Box-Behnken设计安排实验，实验因素和水平安排见表1。

表1 Box-Behnken design实验设计因素和水平表

2.5.2 数据处理 按表2中Box-behnken实验设计的处方，采用乳化溶剂挥发法制备PLGA纳米粒，并分别测定粒径大小、包封率及载药量等3个响应值，结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计表及响应值

从上述实验的结果可知，褪黑素PLGA纳米粒的粒径变化范围是198～388 nm，包封率的变化范围是11.67 %～69.77 %，载药量的变化范围是5.62 %～11.54 %，利用Box-Behnken design实验设计软件对各响应值进行回归分析，根据独立变量与响应值之间的相互关系，分别进行线性（Linear），两因素交叉方程（2F）及二项式指数方程（Quadratic）的拟合，分析各变量之间的调整系数r2及预测系数r2以确定拟合方程的归属，结果见表3。

表3 响应值模型方程拟合结果表

从表3可知，与其它模型相比较，由于二项式指数方程模型具有较大的r2，故选择包含相互因素与二项式模型来描述各变量对响应值的作用。二项式方程如下：

将各独立变量对响应值的影响进行统计分析，以探讨三个变量之间对响应值影响的大小，各变量前的符号和数值大小表示影响响应值的趋势和重要性。

在考察对粒径大小的影响因素中，PLGA的浓度（X1）、PVA的浓度（X3），药物与PLGA的比例及PVA的浓度的交互项（X2X3）为影响PLGA纳米粒粒径大小的显著因素，所拟合的二项式方程为：Y1=241.23+33.97X1+0.82X2-62.38X3-0.62X1X2-8.47X1X3-19.93X2X3-15.70X12+1.05X22+48.10X32

作为纳米药物递送系统，包封率与载药量是较为重要的两个参数。影响包封率的主要因素包括PLGA的浓度（X1）及PLGA浓度的二项式模型（X12）。相应的回归方程可用下列公式表述：Y2=50.32+22.53X1-1.46X2+4.16X3+1.55X1X2-0.37X1X3+4.19X2X3-11.63X12+3.58X22-3.83X32

经统计学检验分析模型的F值为16.84，相关系数r2=0.968 1，P=0.003 1＜0.01，表明模型方程显著，可以选择包封率作为预测褪黑素PLGA纳米粒的最优处方。影响载药量的主要因素为PLGA的浓度（X1）及药物与PLGA比例的二项式模型（X22）两个参数。回归方程为：Y3=10.30+1.75X1-0.26X2+0.47X3-0.11X1X2+0.16X1X3+0.31X2X3-0.76X12-2.18X22-1.12X32。经统计学检验分析模型的F值为5.89，相关系数r2=0.900 8，P=0.032 5＜0.05，回归方程的代表性较好，提示该载药量响应值能用于预测PLGA纳米粒的最优处方。

2.5.3 效应面分析预测与处方优化 根据实验设计的限定条件要求，希望获得较小的粒径及较高包封率与载药量的处方，应用Design expert 实验设计软件绘制各因变量对响应值影响的三维曲面图，探讨各因素对相应值的影响。结果见图1。

图1 各因素与响应值的三维图

根据预期设定的目标条件对褪黑素PLGA纳米粒进行处方优化，设定较小的粒径，维持较高的包封率和载药量，由Design expert实验设计软件得到最优化处方为：PLGA（X1）=3.5 mg/mL，药物与PLGA的比例（X2）=0.76%，PVA浓度（X3）=0.4 mg/mL。

2.5.4 工艺验证 按最优处方制备3批褪黑素PLGA纳米粒，按“2.3及2.4项下方法”分别测定其包封率、载药量及粒径大小，结果见表4。从表4可知，实验的实测值和模型预测值比较接近，偏差＜5%，表明模型的预测性良好，模型可以用来优化褪黑素PLGA纳米粒的处方。

表4 褪黑素PLGA纳米粒验证实验

2.6 褪黑素PLGA 纳米粒的粒径及形貌观察 将所制备的褪黑素PLGA纳米粒稀释后，采用激光粒度测定仪进行粒度大小的测定，结果见图2，粒径大小为242.2±6 nm，多分散指数PDI为0.105，提示粒度分布较为均匀。采用透射电镜观察所制备褪黑素PLGA纳米粒的外观形貌，取褪黑素纳米粒滴于400目铜网上，采用2 % 磷钨酸溶液进行负染，样品晾干后，置于透射电镜下进行观察，结果见2，从透射电镜结果可知，所制备的PLGA纳米粒表面光滑，颗粒之间没有出现聚集黏连。

Size Distribution by Number

图2 褪黑素PLGA纳米粒粒径及透射电镜形貌观察

3 讨论

本实验通过采用可生物降解的高分子聚合物PLGA作为载体材料，利用Box-behnken响应面设计优化该纳米粒的处方，考虑到不同因素之间的交互作用，以粒径大小，载药量及包封率为多指标响应值，通过拟合方程得到PLGA质量浓度、药物与PLGA的比例以及乳化剂PVA浓度三者之间关系的二项式模型，根据设定的目标条件获得优化处方，验证结果表明模型预测值与实测值之间的偏差较小，为后续制剂的研究奠定了基础。

在药物制剂的处方设计过程中，均匀实验与正交实验为经常采用的实验设计方案，而Boxbehnken设计基于非线性模式进行设计和研究，在曲面范围内将复杂未知的函数关系在小区域内用不同的数学方程模型来拟合。为此BBD对目标值拟和更为精确，响应曲面的描绘细致，适用于当影响因素少许变化时目标值响应特别敏感的非线性部分［10-11］。

在PLGA纳米粒的制备过程中，由响应值的曲面图可知，当固定乳化剂PVA的量不变的情况下，随载体材料PLGA用量的增加，纳米粒的粒径呈增加的趋势，而药物量的改变对粒径的影响不明显，提示在当前设定的条件下，载体材料用量的增加，会增加所制备的纳米粒的粒径，包封率和载药量也呈现相同的增加的趋势，这与所用到的载体材料越多，可以提供足够大的空间范围能够将药物包载在纳米粒中，并且有机相的黏度增加，可以减少溶剂挥发纳米粒固化过程中药物向外水相的流失，故有较高的包封率与载药量［12］。当乳化剂PVA的量增加时，所制备的纳米粒的粒径呈减少趋势，这与PVA作为乳化剂有关，可以更多地降低有机相与水相之间的表面张力，可形成较小的乳滴，在有机溶剂挥发后可以固化成粒径较小的纳米粒，而PVA的浓度对包封率和载药量影响不显著。同时由于PVA的黏度较高，可以吸附在PLGA纳米颗粒的表面，防止纳米粒之间出现黏连与沉积。