氯氨酮通过抑制炎症因子表达保护脓毒症大鼠心肌细胞功能①

刘 宇 李 耀 万永灵

(四川省人民医院麻醉科，成都610031)

脓毒症是一种因患者全身出现的恶性炎症反应，主要由于各种感染、创伤、外科手术等反复刺激导致机体产生大量炎症因子产生的疾病，患者病情多变且不稳定，容易合并急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)或心肌细胞凋亡等，随着病情的发展可能会出现多器官功能衰竭[1,2]。氯氨酮又称凯他敏、盐酸氯胺酮，是一种静脉全麻药[3,4]。目前主要用于各种小手术或诊断操作时的麻醉，研究表明，氯氨酮与大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡密切相关[5]。本文旨在探究氯氨酮对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡、免疫功能紊乱及Bax、Bcl-2表达的影响，以期了解氯氨酮对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡、免疫功能紊乱以及Bax、Bcl-2表达的作用机制，为脓毒症患者的治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 SPF级3周龄SD大鼠75只，购自广东医学院实验动物中心，合格证号：粤监证字 2004A029，于15个笼中饲养，5只/笼。所有大鼠均在本院动物中心实验室饲养。

1.1.2药物与试剂 苏木素、伊红购自武汉博士德生物有限公司；中性福尔马林、酒精、二甲苯购自天津科密欧有限公司；IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α试剂盒购自美国Sigma 公司；肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)，肌红蛋白(Myoglobin,Mb) 和肌酸激酶(creatine kinase,CK)试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；Bcl-2、Bax抗体购自北京傲锐东源生物科技有限公司；Caspase-3抗体购自武汉华联科有限公司；TRIzol 试剂购自Thermo Fisher公司；SYBR PCR Master Mix试剂盒购自日本TOYOBO公司。

1.1.3仪器 TDL-5 型台式离心机购自上海安亭科学仪器厂；光学显微镜购自东莞市同创仪器有限公司；切片机购自德国Leica公司；蛋白电泳及转膜仪购自美国Bio-Rad公司；BS-124s 型电子天平购自北京赛多斯仪器系统有限公司。

1.2方法

1.2.1建立模型 将75只大鼠适应性喂养 1 周，随机选15只为正常对照组，其余60只大鼠采用盲肠结扎穿孔(CLP)法建立中度脓毒症模型，制作方法及判断模型是否成功参考文献[6]。具体操作如下：戊巴比妥钠麻醉大鼠，沿腹做切口，取出大鼠盲肠后线结扎50%近端盲肠，并使用18号针头穿孔盲肠2次，两针孔相距约2 mm，挤出少量粪便后将其放回腹腔，逐层关腹，消毒。

1.2.2分组及药物干预 将75只大鼠随机平均分为5组，每组15只，分别为：空白对照组(Control)、诱导模型组(CLP)、低浓度氯胺酮组(Ketamine 10 mg/kg)、中浓度氯胺酮组(Ketamine 20 mg/kg)、高浓度氯胺酮组(Ketamine 40 mg/kg)。氯胺酮处理的各组大鼠分别在模型制备成功后15 min按照上述浓度肌肉注射氯胺酮，空白对照组和诱导模型组分别注射等量生理盐水，氯胺酮处理4 h后处死大鼠。

1.2.3HE染色观察大鼠心脏的病理损伤情况 多聚甲醛固定大鼠组织后石蜡保存，制成组织切片，使用不同体积分数的乙醇梯度入水，PBS浸洗后浸入苏木素染色3～5 min，水洗，再使用酸水和氨水分别浸润、水洗；最后置于伊红染色2 min，洗去多余染液，滤纸吸干，迅速滴加适量中性树胶，盖玻片封固，显微镜下观察染色情况并分析。

1.2.4ELISA 从大鼠颈总动脉插管接取0.5 ml血液，分别按IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、CK-MB、Mb和CK的试剂盒说明书检测大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、CK-MB、Mb和CK含量。

1.2.5Western blot 取大鼠心脏组织提取总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，半干法将蛋白转移到PVDF膜，置于5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加入各自需要检测蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，TBS洗净，以GAPDH为内参蛋白，显色液显色后检测吸光度，计算各蛋白相对表达量。

1.2.6免疫组化 对石蜡切片进行常规脱蜡，过氧化氢甲醇液室温浸泡15 min并使用胃蛋白酶消化，滴加一抗，Caspase-3置于湿盒中恒温冰箱保存过夜，PBS清洗后滴加二抗，37℃孵育60 min后PBS清洗，显色后苏木素复染1 min脱水并封片，光学显微镜下观察。

1.2.7RT-PCR TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度后，反转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增，SYBR PCR Master Mix试剂盒检测Bax和Bcl-2表达水平，以GAPDH为内参。

1.3统计学方法 数据分析和作图分别采用SPSS 22.0和GraphPad Prism5软件，方差分析使用单因素方差分析，当组间差异存在统计学意义时，采用SNK方法进行进一步比较；以P<0.05为数据差异有统计学意义，本研究所有检验均为双侧检验。

2 结果

2.1各组大鼠心脏病理损伤观察结果 对照组大鼠心肌组织正常，肌外膜完整，可见血管及神经；心肌纤维完整，肌细胞核大小形态未见异常，肌纤维纵切面可见周期性明暗相间横纹，其余未见异常；诱导模型组大鼠心肌的镜下部分肌纤维弯曲，部分肌红蛋白溶解，肌细胞核固缩、溶解，肌束膜破裂；低浓度氯胺酮组大鼠心肌组织少量肌纤维断裂溶解弯曲，其余未见异常；中、低浓度氯胺酮组大鼠心肌组织基本正常，肌外膜完整，可见血管及神经；肌束膜包裹肌纤维，肌纤维完整，肌细胞核大小形态未见异常，肌纤维纵切面可见明暗相间周期性横纹；高、低浓度氯胺酮组心肌组织少量肌纤维断裂溶解弯曲，其余未见异常。见图1。

2.2各组大鼠血清中心损标记物检测 由图2可知，相比对照组，诱导模型组大鼠Mb、CK、CK-MB水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；相比诱导模型组，氯胺酮处理各组大鼠Mb、CK、CK-MB水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈浓度依赖性。

2.3各组大鼠心肌组织Caspase-3表达 由图3可知，相比对照组，诱导模型组大鼠Caspase-3蛋白表达水平及Caspase-3阳性细胞百分比显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；相比诱导模型组，使用氯胺酮处理各组大鼠Caspase-3蛋白表达水平及Caspase-3阳性细胞百分比显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈浓度依赖性。

图1 各组大鼠心脏病理损伤观察结果(×400)Fig.1 Observation results of cardiac pathological dama-ges of rats in each group(×400)

图2 各组大鼠血清损伤标记物检测结果Fig.2 Detection results of heart damage markers in rats serum of each groupNote: Compared with control，*.P<0.05；compared with CLP group,#.P<0.05.

图3 各组大鼠心肌组织Caspase-3表达

2.4各组大鼠外周血中炎症因子检测结果 由图4可知，相比对照组，诱导模型组大鼠外周血IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高，IL-10水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；相比诱导模型组，氯胺酮处理各组大鼠外周血IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低，IL-10水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且呈浓度依赖性。

图4 各组大鼠外周血中炎症因子检测结果Fig.4 Detection results of inflammatory factors in rats peripheral blood of each groupNote: Compared with control，*.P<0.05；compared with CLP group,#.P<0.05.

图5 各组大鼠Bax、Bcl-2基因表达检测结果Fig.5 Detection results of Bax and Bcl-2 gene expression in rats of each groupNote: 1.Control；2.CLP；3.Ketamine 10 mg/kg；4.Ketamine 20 mg/kg；5.Ketamine 40 mg/kg.Compared with control，*.P<0.05；compared with CLP group,#.P<0.05.

2.5各组大鼠Bax、Bcl-2基因表达 由图5可知，相比对照组，诱导模型组大鼠Bax蛋白表达水平及mRNA表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平及mRNA表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；相比诱导模型组，氯胺酮组大鼠各组大鼠Bax蛋白及mRNA表达降低，Bcl-2蛋白及mRNA表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且变化呈浓度依赖性。

3 讨论

脓毒症可加重大鼠体内炎症反应，调节炎症反应的细胞因子主要包括促炎因子和抗炎因子，这两种因子为拮抗作用。当促炎因子水平升高，则体内炎症因子水平降低，表明体内炎症反应加剧；抗炎因子升高，体内炎症因子受到抑制，则炎症反应减弱[7]。目前研究较多的促炎细胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等[8]；抗炎细胞因子则包括IL-4、IL-10、IL-1等[9]。TNF-α可引起心肌细胞产生代谢性应激反应，导致代谢产物增多，促使局部炎症介质大量合成[10]。TNF-α还可作用于中性粒细胞、巨噬细胞，使其广泛释放炎症介质从而减少心肌细胞供血，导致心肌细胞缺氧、蛋白聚糖合成能力下降及Ⅰ型和Ⅱ型胶原比例失调。同时IL-6也可促进组织中MMPs、前列腺素等炎症物质产生和表达，加速炎症反应。IL-1α可增加MMP-3等基质金属蛋白酶降解酶在心肌细胞中的合成和分泌。本研究发现氯氨酮处理后大鼠外周血炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著降低、抗炎症因子IL-10水平显著升高，说明大鼠体内的炎症反应显著降低，提示氯氨酮可以通过降低炎症反应保护心肌细胞。随着氯氨酮处理浓度增加，炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著降低、抗炎症因子IL-10水平显著升高，在一定浓度范围内呈浓度依赖性。黄婷等[11]研究表明，降低炎症反应可保护心肌细胞，与本研究得出的结论一致。

目前常见的心肌损伤生物标志物主要包括Mb、CK-MB和CK，三者在心肌细胞中含量丰富。周伟梁等[12]和Liebetrau等[13]的研究显示，当心肌细胞受损时，上述蛋白会通过破裂的细胞迅速释放到细胞，因此可以作为心肌损伤的生物标志物。本研究结果显示，氯氨酮处理后大鼠Mb、CK、CK-MB水平显著降低，即大鼠心肌细胞受损程度显著降低。随着使用氯氨酮处理浓度增加，心肌损伤的生物标志物Mb、CK、CK-MB水平逐渐降低，且呈氯氨酮剂量依赖性。沈定荣等[14]研究表明，降低Mb、CK、CK-MB使心肌细胞受损程度显著降低，与本研究得出的结论一致。

脓毒症除了使大鼠心肌细胞坏死外，还有另外一种细胞死亡形式，即细胞凋亡。细胞凋亡是一种有序或程序性的细胞死亡方式，这种程序性死亡是受相关基因调控的细胞主动性死亡过程[15，16]。Caspase是细胞凋亡的核心，Caspase-3、Caspase-9等是Caspase家族的凋亡因子[17]。贾晓鹏等[18]通过前列腺腺癌细胞实验分析得出，Caspase-9基因处于Caspase 家族激活基因的顶端，是Caspase家族中最常见的凋亡启动子，通过自身的裂解使proCaspase-3产生有活性的Caspase-3。这种有活性的Caspase-3是执行凋亡的基因，主要作用机理是通过剪切另外的 Caspase 底物引起级联反应，最终导致细胞凋亡。细胞凋亡的调控因子较多，除Caspase家族外，Bcl-2 家族也是常见的凋亡控制基因。Bcl-2 家族主要由Bcl-2和Bax两种蛋白的表达量决定细胞是否凋亡[19-21]。Bax和Bcl-2表达呈相反趋势，当Bcl-2表达下降时 Bax 表达上升，此时会促进细胞凋亡；当Bcl-2表达升高，Bax表达降低时，则会抑制细胞的凋亡。本研究表明，相比模型组，氯氨酮处理大鼠Bax、Caspase-3水平显著降低、Bcl-2水平显著升高，说明大鼠心肌细胞凋亡受到显著抑制，且呈氯氨酮浓度依赖性。陈欢[22]研究表明，氯氨酮可以抑制心肌细胞的凋亡，与本研究的结论一致。

综上所述，氯氨酮可通过调节大鼠心肌细胞内凋亡因子水平和免疫功能保护脓毒症大鼠心肌细胞，且在一定范围内呈浓度依赖性，其作用机制可能与降低心肌细胞内凋亡因子和促炎因子水平、升高抗凋亡因子和抗炎因子水平有关。但本研究的心肌细胞凋亡指标较少，在后续的实验中，将使用流式细胞术等方法进一步探讨氯氨酮对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡机制。