过敏原Der p 23重组蛋白制备及其特异性IgE化学发光检测方法的建立①

周 鹰 吴美丽 朱晗婷 崔玉宝③

(南京医科大学附属无锡市儿童医院儿科实验室，无锡214023)

尘螨种类较多，其中有30余种与人类疾病密切相关，是过敏性哮喘、过敏性鼻炎和消化道过敏性疾病的重要危险因素[1]。尘螨及其过敏原通过氧化反应损伤肺细胞的蛋白质、脂质和DNA，通过酶水解作用引起胃肠道炎症[2]。我国呼吸道过敏性疾病研究联盟对17座城市6 304例哮喘合并/或鼻炎患者进行了调查，粉尘螨、屋尘螨和热带无爪螨皮肤挑刺试验阳性率分别为59%、57.6%和40.7%，说明此3种螨是我国过敏性疾病常见致敏螨种[3]。

引起过敏性疾病的抗原物质称为过敏原。世界卫生组织/国际免疫联合会根据生物体产生的过敏原的发现顺序及氨基酸序列同源性予以命名，已公布屋尘螨过敏原23组分、粉尘螨过敏原32组分、热带无爪螨过敏原14组分。2013年，澳大利亚学者Weghofer等[4]报道从屋尘螨gt11cDNA表达文库中筛选出过敏原Der p 23，其大肠杆菌表达产物可与74%屋尘螨过敏患者血清结合，阳性率高于过敏原主要组分Der p 1和Der p 2，因此被认为是新发现的屋尘螨过敏原主要组分。本研究制备屋尘螨重组蛋白Der p 23，建立了化学发光法检测该组分与屋尘螨过敏性疾病患者血清IgE结合率，结果报告如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1血清 采集南京医科大学附属无锡市人民医院检验科过敏原检测获得的屋尘螨过敏原阳性血清(Mediwiss Analytic GmbH，德国)，且乙肝表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎抗体(抗-HCV抗体)、人类免疫缺陷病毒1/2抗体(抗-HIV 1/2抗体)和梅毒螺旋体抗体(抗-TP抗体)均为阴性。所有血清经确认屋尘螨过敏原特异性阳性，即特异性IgE > 0.35 KU/L。阳性血清中，2例1级、11例2级、15例3级、7例4级、5例5级、9例6级，患者的临床诊断为过敏性鼻炎或/和过敏性哮喘。本研究经无锡市人民医院伦理委员会批准(伦理审查号：KYLLH2018034)，因所用血清样本为临床检验剩余样本，无需知情同意。

1.1.2试剂 载体pET28a(+)和大肠埃希氏菌菌株E.coliBL21(DE3)plysS为本实验保存。工具酶BamHⅠ和NotⅠ、DNA ladder、E.coliCompetent Cells JM109 (Code No.D9052)、RNAiso Plus Kit (Code No.9108Q)、PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Code No.RR014A)、TksGflex DNA Polymerase Kit(Code No.R060A)、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)购自TaKaRa公司；In-Fusion®HD Cloning Kit (Code No.639648)购自Clontech公司；HiTrap TALON crude、5ml TALON Superflow (Code No.28-9537-66)购自美国GE公司；RNAeasy Mini Kit (Qiagen 74104)购自Qiagen公司；HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG购自Zymed Laboratories(CA,USA)；PVDF膜、Western blot膜封闭液、CBB-R250染色液购自天根生化科技有限公司；BCIP/NBT购自Roche公司；亲和色谱填料镍琼脂糖凝胶FF购自北京卓冠科技有限公司产品。

1.1.3仪器 Phadia过敏原检测仪(ImmunoCAP System,ThermofisherScienfific,Uppsala,Sweden)购自美国赛默飞；PCR仪(Cat No.TP600)购自TaKaRa公司；Mupid电泳仪购自Advance-Bio 公司；ImageMaster®VDS电泳成像装置购自Pharmacia Biotech公司；ABI PRISM TM 377XL DNA Sequencer DNA测序仪购自Perkin Elmer公司。

1.2方法

1.2.1屋尘螨培养 根据参考文献[5]培养屋尘螨，培养基为酵母粉和鱼食按一定比例混合，置于25.1℃、相对湿度(75±5)%培养。

1.2.2引物设计与合成 依据GenBank公布的序列(No.EU414751)，去掉5′端21个氨基酸的编码序列，设计并合成引物，F：5′-AATGGGTCGCGGATCCGCCAATGATAATGATGATGATCCTACC-3′，R： 5′-T-GCTCGAGTGCGGCCGCTTAAGTGCATGTTTCTTCATC-TTCATTC-3′，片段两侧添加BamHⅠ/NotⅠ 酶切位点。

1.2.3质粒pET28a(+)-Der p 23构建 用RNAiso Plus Kit提取屋尘螨Total RNA，以Total RNA为模板，使用PrimeScriptTMRT-PCR Kit合成cDNA，以反转录的cDNA为模板，以INF1/INR1为引物进行PCR扩增，取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.切胶回收目的扩增条带，使用In-Fusion®HD Cloning Kit将回收的目的基因与质粒pET28a(+)进行连接反应，反应产物热转化至E.coliCompetent Cells JM109中，挑选阳性菌落植菌，提取质粒，使用引物T7、T7terminator进行测序验证。

1.2.4目的蛋白表达、纯化与鉴定 取1 μl质粒pET28a(+)-Der p 23转化至Competent cell Rosetta 2(DE3) pLysS中，各取80 μl 转化液分别涂布含于抗生素Kana(50 μg/ml) 平板和LB抗生素Kana(50 μg/ml)+Cm(34 μg/ml) 平板，37℃培养过夜。以空质粒pET28a(+)为对照同步操作。挑取单菌落分别放置于2 ml LB/Kana(50 μg/ml)和2 ml LB/Kana(50 μg/ml) + Cm(34 μg/ml)培养基，37℃培养过夜。行主培养诱导，在Glass tube中加入5 ml LB/Kana(50 μg/ml)和5 ml LB/Kana(50 μg/ml) + Cm(34 μg/ml)培养基，添加培养菌液100 μl。37℃培养至OD600为0.6，加入150 mmol IPTG 34 μl(final 1 mmol IPTG) 进行诱导，37℃培养4 h。集菌前吸光度值为1.80，集菌后，在菌体中加入320 μl PBS悬浊后进行超声波破碎，12 000 r/min离心5 min。取全蛋白提取物、上清液、沉淀物各8 μl，加入2 μl 4×SDS Loading Buffer，95℃加热10 min，行SDS-PAGE电泳。电泳条件：25 mA/枚、70 min，12.5% polyacrylamide gel，CBB-R250染色，脱色液脱色。转膜，将PVDF膜置于含1.5% BSA 的12 ml Blocking Buffer 中，4℃平放过夜封闭。取稀释后的Penta-His Antibody溶液9 ml，加入一抗反应1 h。TBST缓冲液(20 ml)洗涤2次，TBS缓冲液冲洗3次。使用稀释后的HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG抗体溶液9 ml，加入二抗反应1 h。TBST缓冲液(20 ml)洗涤2次，TBS缓冲液冲洗3次。1 ml TrueBlue Peroxidase Substrate显色1 min。

1.2.5化学发光检测方法的建立 取重组蛋白，配制成5 μg/ml溶液。按照说明书操作：①包被：采用重组蛋白包被化学发光板，2～8℃过夜，加150 μl 4% BSA-PBS，37℃封闭2 h，置于37℃干燥2 h;②加样：取重组过敏原包被的化学发光板，50 μl/孔加入样品稀释液混匀。质控品孔中加入100 μl SS2(磷酸盐缓冲液，含3.5 U/ml 人IgE、2% BSA和0.25%%Proclin-300)和SS4(磷酸盐缓冲液、含17.51 U/ml 人IgE、含2% BSA和0.25 Proclin-300);③孵育：用封板膜封好包被板，37℃孵育45 min；④洗板：每孔加入不少于350 μl稀释好的工作洗液，静置30 min，拍干，共洗板5次;⑤第2次加样：100 μl/孔加入酶结合物；⑥孵育；⑦洗板；⑧加发光底物液：每孔加入底物A液(柠檬酸-氢氧化钠缓冲液、Luminol)和B液(柠檬酸-乙酸钠缓冲液、过氧化氢脲)各50 μl，振荡混匀，室温避光放置5 min;⑨化学发光免疫分析仪测量每孔RLU;⑩结果计算：选用双对数拟合软件自动计算出待测样本结果。

1.2.6方法学比对 以美国赛默飞Phadia过敏原诊断结果为金标准，计算本文化学发光法检测的Der p 23特异性IgE阴性、阳性测定值，并进行χ2检验。

1.3统计学处理 采用SPSS18.0软件进行数据分析。两组样本率比较采用χ2检验，以曲线下面积(AUC)作为衡量依据，取Youden指数最大时作为最佳截断(Cut-off)值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1屋尘螨过敏原Der p 23重组蛋白制备结果 以屋尘螨Total RNA为模板,RT-PCR扩增Der p 23的活性部位编码基因见图1，将构建的原核表达质粒pET28a(+)-Der p 23转化至Competent cell Rosetta 2(DE3) pLysS中，IPTG诱导表达，柱层析纯化，获得目的蛋白0.5 ml，浓度为0.25 mg/ml，纯度>95%，SDS-PAGE鉴定结果及Western blot目的条带结果见图2。

2.2化学发光检测方法的建立 以国际通行的>0.35 U/ml为阈值判定标准，49例患者中，有44例与重组蛋白Der p 23反应，反应率为89.8%。以UniCAP方法同步检测呈过敏性疾病患者血清，47例呈阳性，阳性反应率为95.92%。两种方法检测结果差异无统计学意义(χ2=0.237，P=0.626)。以UniCAP方法为状态变量，以本文所建化学发光法作为检验变量，绘制ROC曲线，AUC为0.952。见图3。

图1 Der p 23 PCR产物电泳图和序列测定结果Fig.1 PCR amplification of Der p 23 identified by agarose electrophoresis and nucleotide sequencing Note:A.PCR agarose electrophoresis;B.Nucleotide sequencing.M1.DL2000 DNA Marker;1.pET28a(+)-Der p 23;2.RT-PCR product of Der p 23.

图2 纯化后的重组蛋白鉴定Fig.2 Identification of recombinant protein after purificationNote:A.SDS-PAGE;B.Western blot;M.Protein MW marker(broad);1.2 μl of recombinant protein; 2.4 μl of recombinant protein;3.200 ng BSA;4.500 ng BSA;5.1 000 ng BSA;6.1 500 ng BSA;7.2 000 ng BSA.B.M1.Precision plus protein standards; 8.1 μl recombinant protein;M2.Perfect protein marker.

图3 尘螨过敏原Der p 23特异性IgE化学发光法ROC曲线Fig.3 ROC curve for Der p 23 specific IgE detected by chemiluminescence

3 讨论

Chua等[6]报道了屋尘螨过敏原第1组分cDNA克隆和基因序列。目前，世界卫生组织/国际免疫联合会官网(www.allergen.org)已公布屋尘螨过敏原23组分，其中第1组分Der p 1和第2组分Der p 2与屋尘螨过敏性疾病患者血清IgE结合率为60%～100%，被认为是主要组分。在粗提浸液质量标准化时，以第1、2组分浓度测定为依据。近年发现屋尘螨过敏原第23组分Der p 23也是过敏原的主要组分，与Der p 1、Der p 2具有同等重要的临床价值，其血清IgE结合率高达46%～74%[7]。Der p 23位于螨粪球几丁质膜，嗜碱性粒细胞脱颗粒试验显示其活性较高[8]。本研究检测49例屋尘螨过敏性疾病患者血清，Der p 23单组分反应率高达89.8%，表明该组分过敏原是我国过敏性疾病患者重要的致敏蛋白之一。

目前，临床检测过敏原主要采用尘螨粗提浸液制品为包被抗原，不同批次产品含有的过敏原单组分种类及含量不稳定，某种或某些组分的免疫原性偏低，含有非过敏原性物质，甚至有毒物质，所以很难实现质量标准化，从而影响检测结果[9，10]。重组DNA技术为过敏原制备提供了新的手段，重组过敏原单组分的优点是物理、化学、免疫学特征明确。用纯化或重组的过敏原单组分进行组分分辨诊断能够从分子水平检测患者过敏谱，提高诊断精准性，从交叉反应中鉴别出致敏原单组分，评估过敏反应类型，帮助临床选择合适的过敏原单组分进行脱敏治疗[11，12]。北京协和新华联公司销售的化学发光免疫分析法检测试剂盒检测过敏原特异性IgE采用的是粗提过敏原浸液，包括蒿属花粉、屋尘螨、花生等22种。本文参考该试剂盒说明书，以重组过敏原单组分包被化学发光板建立了化学发光检测方法，检测了针对Der p 23的特异性IgE。美国赛默飞Phadia过敏原诊断系统采用粗提浸液为包被抗原，已开发出Der p 1、Der p 2、Der p 23的单组分检测试剂，但目前仅限于科学研究使用。比较本文建立的化学发光免疫分析法和Phadia过敏原Der p 23检测结果，差异无统计学意义，说明本文成功建立了过敏原单组分化学发光免疫分析法。