IL-12在血象恢复领域的非临床药效研究进展

陈丽娜，王亚俊，庄 婕，丁会芹*

（1. 康立泰药业有限公司，山东 青岛 266112；2. 山东省药学科学院，山东 济南 250101）

肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病之一[1-2]，其最基本和最普遍的主要治疗方式仍为手术和放疗、化疗。但放疗和化疗在杀灭肿瘤细胞的同时，也会对正常组织细胞造成破坏，引起骨髓抑制及其并发症如粒细胞、血小板减少等[3]。近年研究发现，白介素-12（inlerleukin-12，IL-12）能通过保护骨髓微环境或刺激其他细胞因子[4]，诱导长期造血重建干细胞增殖并向短期造血重建干细胞分化、成熟，再分化形成祖细胞，从而促进全血象的恢复，显著提高生存率，其效果非常明显。

国内外均采用小鼠或猴作为实验动物，用于放疗、化疗后血象恢复领域的研究。辐射导致的骨髓抑制较化疗更为严重，呈全血象降低，尤以白细胞和血小板的降低显著。动物各组织器官对辐射及化疗药物的敏感性不同，骨髓造血系统是最敏感的器官，其次是胃肠道系统。通过观察动物死亡率、血象指标、免疫因子、血象谷值及其出现时间和持续时间等指标，评价IL-12在血象恢复和造血重建方面的药效。

1 重组鼠源IL-12（rmIL-12）的血象恢复作用

1.1 rmIL-12的辐射防护效应

IL-12有刺激骨髓造血的功能，还能促进辐射小鼠的外周血象恢复，并能延长全身辐射损伤小鼠的生存期。接受致死剂量辐射的小鼠[5]，于辐射前48，36，24，12 h，及辐射后1，12，24，36 h单次静脉注射rmIL-12，辐射前24 h和辐射后1 h给予IL-12的小鼠长期存活率（大于1年）分别为91.4 %和75 %，而对照组小鼠辐射后25 d内全部死亡。评估照射后小鼠的骨髓病理学变化，发现实验组和对照组小鼠骨髓的细胞结构均严重受损，而照射后第12天给药组小鼠骨髓的造血细胞集落出现扩增，但对照组无此现象；第14天给药组小鼠骨髓细胞结构基本恢复至正常水平，而对照组小鼠骨髓仍然严重损伤，结果表明，IL-12有刺激骨髓造血的功能。

同时发现，rmIL-12还能促进辐射小鼠的外周血象恢复。致死剂量（10 Gy）照射后，rmIL-12治疗组和对照组的外周血细胞计数（peripheral blood cell count，PBCC）在第12天下降至最低点，然后rmIL-12治疗组小鼠的PBCC开始恢复，而对照组小鼠全部死亡；在亚致死剂量（5 Gy）照射组，rmIL-12给药组显著减弱了PBCC的降低，并加速了PBCC恢复。值得注意的发现是，IL-12促进了全血细胞恢复，包括白细胞、红细胞和血小板。

另一项研究也表明[6]，照射后给予IL-12可延长全身辐射（total body irradiation，TBI）损伤小鼠的生存期。小鼠经8 Gy TBI后24 h和72 h两次皮下注射10 ng/鼠rmIL-12或安慰剂，实验组小鼠30 d存活率为87.5 %，而安慰剂组小鼠30 d存活率仅为14 %。其后研究表明，单次注射IL-12也有良好的辐射防护作用：经9 Gy TBI后24，48或72 h单次注射IL-12（30 ng/鼠）均能显著延长小鼠的生存时间。与安慰剂组对比，IL-12给药后动物存活率更高，且照射后24 h比48 h给药能获得更高的生存率。安慰剂组与照射后24 h给药组的存活率有显著的统计学差异。

不同辐射剂量的研究表明，IL-12增加生存率的作用不受小鼠辐射剂量的影响。受试小鼠接受3个不同辐射剂量TBI 24 h后，单次注射20 ng/鼠的IL-12均能显著提高动物的存活率。8.6，8.8和9.0 Gy 3个辐射剂量照射后，安慰剂组的存活率分别为20 %、10 %和0，而给药组的存活率分别为80 %，60 %和70 %。值得注意的是，增加辐射剂量后单次注射相同剂量的IL-12，小鼠的存活率基本相同，这意味着IL-12的功效并没有因为辐射剂量的增加而降低。

病理学分析表明，IL-12能减轻辐射后小鼠骨髓和小肠损伤。经8.0 Gy TBI 24 h后使用安慰剂或IL-12，辐射12 d后，安慰剂组小鼠的骨髓几乎没有造血再生迹象，而所有IL-12治疗组小鼠骨髓表现出不同程度的造血重建，出现髓系祖细胞、巨核细胞和成骨细胞。以上研究数据表明，在免疫系统、骨髓和胃肠道等辐射损伤重叠时，IL-12对这3种对辐射敏感的组织均有缓解作用。

Basile等[7]构建了两种荷瘤小鼠模型，EL4淋巴瘤模型和Lewis肺癌模型，并分别给予放疗和化疗，研究IL-12对荷瘤小鼠血象恢复的作用。放疗研究中，对荷瘤小鼠进行137Cs全身照射建模。rmIL-12分预给药组、后给药组及预-后给药组，对照组为安慰剂（PBS）或粒细胞集落刺激因子（G-CSF）。中性粒细胞计数结果表明，淋巴瘤模型中的rmIL-12预-后给药组第14天已达到正常水平，早于其他组。两种肿瘤模型中，只有IL-12预-后治疗组在早期（第7天）取得了显著的红细胞恢复效果。血小板计数结果表明，在第21天，所有rmIL-12治疗组均表现出显著的血小板恢复效果。同时相对于G-CSF治疗组，第21天所有IL-12治疗组产生具有统计学意义的显著的血小板恢复效果。总之，无论淋巴瘤还是肺癌模型，与G-CSF给药组与对照组相比，IL-12预-后分剂量给药组对每一种血细胞的造血恢复均有统计学意义的显著影响。两种肿瘤模型的小鼠肿瘤体积测量结果表明，IL-12同时明显抑制了肿瘤生长。

1.2 rmIL-12对化疗模型动物的血象恢复作用和联合抗肿瘤作用

Basile等[7]向两种荷瘤小鼠腹腔内给予环磷酰胺建立化疗模型。外周血细胞计数结果表明，除了淋巴细胞，两种肿瘤模型的化疗试验均未观察到明显的骨髓抑制。但是，两种肿瘤模型的血细胞抑制与恢复情况也有所不同。Lewis肺癌模型中，与安慰剂组相比第4天观察到rmIL-12预-后给药组和后给药组红细胞计数显著增加。IL-12对血小板计数的影响的差异在两种肿瘤模型中也均有显著意义。EL4淋巴瘤模型中，与安慰剂组相比，IL-12后给药组第8天的血小板计数显著升高；与G-CSF组相比，IL-12后给药组和预-后给药组第8天的血小板计数升高也具有统计学意义。两种肿瘤模型的化疗研究观察期结束时，IL-12联合环磷酰胺治疗使得肿瘤体积显著减小（%T/C＜50 %），而G-CSF治疗均未实现显著的肿瘤减少。同时，化疗联合IL-12给药能明显提高小鼠的无瘤率，在淋巴瘤试验终止时，IL-12预-后给药组和后给药组分别有37.5 %和50 %的小鼠无肿瘤，而安慰剂组未发现无肿瘤小鼠。此项结果表明，IL-12在恢复造血功能的同时还表现出与化疗药物协同抗肿瘤的作用，而G-CSF的抗肿瘤作用却并不明显。

2 重组人源IL-12（rhIL-12）的辐射防护效应

2.1 rhIL-12对放射性辐射恒河猴的辐射防护效应

动物研究中[6]，恒河猴经6.7 G y T B I（LD50/30）照射，rhIL-12在无任何支持性治疗及抗生素治疗情况下分单次或两次给药治疗，结果表明，高低剂量rhIL-12单次或两次给药皆可降低致死剂量照射引起的死亡率。低剂量单次给药组的生存率为71 %，其他治疗组的存活率为75 %，安慰剂组的存活率是50 %。综合以上结果，所有给药组的存活率75 %，明显优于安慰剂组存活率50 %。

研究进一步分析辐照后的血细胞计数变化，12～14 d是血细胞极期，与对照组相比，rhIL-12给药组极期白细胞数量、网织红细胞数量及血小板数量均有显著提高。同样有这种明显趋势的还有中性粒细胞、嗜碱细胞和淋巴细胞，但是差异无统计学意义。

对所有死亡或被安乐死的受试动物进行器官病理分析发现，给药剂量为100 ng/kg和250 ng/kg动物出血发生率均为12.5 %，安慰剂组的出血率为50 %。

Gluzman-Poltorak等[8]进行的一项随机双盲试验中，恒河猴经700 cGy TBI后24～25 h皮下注射单剂量的安慰剂（第1组）或剂量分别为50，100，250和500 ng/kg的rhIL-12（第2～5组），在治疗过程中不给予任何抗生素、液体或血液输注。结果表明，rhIL-12给药组能明显提高辐射动物的生存率。即在第60天时，1～5组的存活率分别是11 %，33 %，39 %，39 %和50 %，所有rhIL-12给药组和对照组比较差异均有统计学意义。同时，通过检测血小板、平均血小板容积、中性粒细胞、淋巴细胞及网织红细胞计数发现，rhIL-12对造血重建表现出很好的促进作用。

上述研究结果表明，rhIL-12可缓解辐射诱导的骨髓抑制。rhIL-12在减少严重中性粒细胞减少症和严重血小板减少症发生方面具有显著作用，同样淋巴细胞、中性粒细胞、血小板及网织红细胞的降低程度也相应减弱。此外，与对照组相比，rhIL-12可提高平均血小板容积，表明rhIL-12可促进新生血小板从骨髓中释放。

对骨髓再生区域数量和大小的定量分析同样支持上述结论，即单独使用rhIL-12即可刺激血细胞生成，使血液各成分恢复。rhIL-12给药组骨髓再生区域的数量和面积均比对照组高，且rhIL-12各给药组的升高程度较相似。与对照组相比，这两个参数在500 ng/kg rhIL-12组中显著升高。

对所有动物进行微生物学和病理学分析，心脏、肾脏、肝脏、双肺、脑及脾脏的细菌学分析结果表明，rhIL-12治疗组动物细菌生长比对照组更少。对照组血培养细菌阳性率是86 %，rhIL-12给药组分别为65 %，65 %，47 %和44 %，250及500 ng/kg菌血症的发生率明显少于对照组（P=0.0072），统计各组所有器官的出血点及胃肠系统的出血点发现，对照组的平均出血点均高于各rhIL-12给药组。

2.2 rhIL-12的辐射防护作用优于G-CSF

一项随机盲法试验中发现[9]，恒河猴经700 cGy致死剂量照射后24～25 h，皮下注射rhIL-12（175 ng/kg）可提高动物60 d后的存活率（rhIL-12组：56 %，对照组：36 %）。在对比研究组中，连续18 d给予G-CSF（每日10 μg/kg）的给药组与对照组相比无生存率优势（G-CSF：31 %，对照组：36 %）。联合用药组单剂量给予rhIL-12并连续给予G-CSF 18 d后，动物的存活率为58 %，和rhIL-12单独用药组相比无统计学意义上的生存率提高（rhIL-12组：56 %）。

血液学方面，rhIL-12给药组极期中性粒细胞、血小板和红细胞计数均显著提高，严重中性粒细胞减少症和严重血小板减少症的发生率也显著减少，而G-CSF组发生率与对照组相当；G-CSF组动物在极期的粒细胞计数与对照组相比无优势，且G-CSF对血小板和网织红细胞计数无改善。结果表明，rhIL-12单次给药可促进骨髓再生，有恢复造血的功能，效果优于连续用药18 d的G-CSF。

骨髓病理评价，接受rhIL-12治疗的动物与对照组相比，髓细胞和红细胞数量有统计学意义上的显著增高（P＜0.05），且数值高于G-CSF组。另外，与对照组相比，rhIL-12组成熟和不成熟的巨核细胞增多，尤其是成熟的巨核细胞更多。

研究分析了各组动物的感染、出血、黏膜炎和胃溃疡情况。IL-12单独给药组和联合用药组与对照组及G-CSF组相比，感染率更低（rhIL-12组44 %，联合用药组46 %，对照组61 %，G-CSF组73 %），rhIL-12单独给药组的感染率明显低于G-CSF组。另外，采用盲法评估60 d之内死亡动物的出血得分，rhIL-12单独给药组也低于G-CSF组和对照组，联合用药组的出血点和对照组相当。与上述结果类似，胃溃疡点也是rhIL-12单独给药组为最低，G-CSF组为最高。

此外，另一项研究发现接受辐射动物的存活率与血细胞谷值密切相关[10]。非人类灵长类动物照射（700 cGy）后24～25 h，单次皮下注射治疗安慰剂（n=64）或rhIL-12（50～500 ng/kg；n=108），或连续注射G-CSF（每日10 μg/kg，n=26）18 d。血细胞分析显示，各组（包括对照组、IL-12组和G-CSF组）所有幸存动物的淋巴细胞、中性粒细胞和血小板的极值中位数都显著高于死亡动物（P＜0.001）。进一步动物死亡与血细胞低谷值（ROC，receiver operating characteristic）曲线分析显示，淋巴细胞阈值0.08×109/L是强烈的死亡预测信号。中性粒细胞和血小板也是死亡预测的强烈信号，而红细胞和网织红细胞提供较少预测生存的信息。而所有动物无论各组单独分析或综合分析，其年龄、性别和体重均与血细胞极值和存活率无显著关联。这项研究意味着促进早期骨髓再生，使所有主要类型的血细胞谷值增加（尤其淋巴细胞、中性粒细胞和血小板），可能是rhIL-12减轻辐射导致重度骨髓抑制致死作用的主要机制。

3 rhIL-12的体外药效研究

除上述体内动物试验外，还有许多文献报道通过外周血或骨髓血单个核细胞集落形成试验，对IL-12的体外药效展开研究。

研究正常人外周血或骨髓血单个核细胞对IL-12的体外药效发现，在其他细胞因子如rhIL-3、EPO或G-CSF等存在的情况下，联合使用rhIL-12能明显增加细胞集落数[11-12]。Jacobsen等[13]研究表明，集落培养试验中，FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）与IL-12或IL-11联合可明显刺激小鼠骨髓造血祖细胞的体外扩增。

关于IL-12刺激造血作用的机制，有种观点认为IL-12通过γ干扰素（IFN-γ）发挥作用。有研究[14]提出IL-12通过Stat4途径产生IFN-γ，进而作用于造血干细胞。虽然已普遍认为IFN-γ在造血方面有重要作用，但其具体作用机制目前还不明确，体外研究发现IFN-γ对造血系统存在两种截然相反的作用：（1）抑制作用。体外试验结果表明[15]，IFN-γ对CD34+细胞的集落培养有明显的抑制作用，且有剂量关系。Zoumbos等[16]用健康志愿者和再障患者的骨髓血单个核细胞进行集落培养试验，用IFN-γ抗体处理后，集落数量明显增多，尤其是再障患者的骨髓血单核细胞，从侧面证明IFN-γ对骨髓造血有抑制作用。（2）促进作用。Zhao等[17]用体内和体外试验同时证明了IFN-γ能诱导Lin-Sca-1+C-Kit+（LSK）细胞的扩增。对野生型小鼠进行IFN-γ刺激后，LSK的比例与对照组相比明显升高；而IFN-γ受体缺陷型和Stat1缺陷型小鼠，IFN-γ处理组LSK比例无升高。Caux等[18]采用体外培养试验证明了IFN-γ能增强IL-3对人CD34+造血祖细胞的增殖作用。IFN-γ与IL-3联合使用，与单独使用IL-3相比，CD34+造血祖细胞的增殖明显升高。但同时也发现，长期培养时，IFN-γ联合IL-3对CD34+造血干/祖细胞有抑制作用，而单独使用IL-3则不会抑制。

结合早期临床研究分析认为IL-12的毒性与IFN-γ的过量生成有关，这意味着IL-12造血作用可能与其剂量有关，低剂量的IL-12可促进造血，而高剂量的IL-12刺激产生过多的IFN-γ抑制造血，并产生毒性反应。同时，上述文献中研究结果的不统一也可能是由使用的试剂不同、试验中添加的生长因子不同、乃至细胞不同造成的。

4 结语

综上，国内外研究均证实IL-12对重度放射损伤所致全血细胞减少症具有很好的治疗作用，能刺激骨髓造血早期恢复，减少出血及感染发生，并能显著提高动物的生存率[19-22]。我国癌症治疗压力逐年加大，放、化疗能直接杀伤或控制肿瘤细胞，因而在临床上得到广泛应用。但由于放化疗特殊的治疗方式导致其对正常组织产生毒性，其中血液学毒性的发生率高，经常导致患者因造血功能抑制而中断治疗，这种造血功能抑制表现为造血组细胞及多系血细胞同时减少，最为明显的是粒细胞和血小板。鉴于IL-12明确的疗效、极高的临床价值、较低的风险，IL-12药物的开发对肿瘤患者放、化疗后血细胞减少的治疗具有重大意义，有可能成为打破传统血象恢复领域局限性的重磅药物。