食品中抗生素残留的预处理及检测方法研究进展

林嫚婷，苏亚霞，胡汉昆

（武汉大学中南医院（武汉大学第二临床学院），湖北 武汉 430071）

抗生素已被广泛用于预防和治疗人类及动物的感染性疾病。但滥用抗生素会诱使细菌产生耐药性,对人体产生毒副作用,导致二重感染，从而威胁到人类的健康。由于农业的日益发展和畜牧业的集约化，大量兽用抗生素被用于预防和治疗动物疾病，或是用作动物体重增长促进剂[1-2]。而这些动物的排泄物、养殖业的排污等又会污染土壤和水质，导致野生动植物体内的抗生素累积。此外，有些商户会将抗生素直接添加到食物中，如添加到牛奶中以延长其新鲜度[3]。如果不加以控制，人类长期低剂量地接触抗生素很可能会导致耐药菌的产生，并在人群和动物群中互相传递。

因此，为了最大限度地减少人类接触抗生素，欧、美等国家的监管机构都出台了一系列法规，要求严格控制食物中抗生素的残留量，这就需要依靠准确、灵敏的分析方法确定食物中的抗生素类别和残留量。本文对近年食品中抗生素残留的前处理及检测方法进行综述，并对未来发展趋势提出展望，以冀为食品中抗生素残留监测方法的完善提供参考。

1 样品预处理技术

1.1 固相萃取（SPE）

SPE是痕量分析中最常用的样品纯化工具之一，它是基于液-固色谱分配原理，通过选择性吸附、选择性洗脱对样品中目标分析物进行分离、纯化和富集。该技术通常是将样品溶液加载至吸附剂上，保留其中的目标分析物，再用适当的溶剂洗去杂质后，用少量不同的溶剂洗脱目标分析物，或选用合适的溶剂直接选择性洗脱目标分析物，也可在加载样品溶液时，选择性吸附其中的干扰杂质，使目标分析物直接流出，从而达到快速分离、净化与浓缩的目的。其中，萃取溶剂和固体吸附剂可根据分析物的不同来选择。Hawari等[4]使用以N-丙基乙二胺（PSA）为吸附剂的SPE柱，提取蜂蜜中几种不同极性的抗生素残留物（磺胺类，四环素类，大环内酯类，林可酰胺类和氨基糖苷类），发现甲醇是提取蜂蜜中各种抗生素残留物最有效的溶剂，分析物的回收率为85 %～111 %。Feng等[5]采用固相萃取技术提取并测定了不同蔬菜样品中的11种抗生素（包括4种磺胺类药物，2种四环素类药物，3种氟喹诺酮类药物，泰乐菌素和氯霉素），并比较了Oasis HLB、C18、NH23种SPE柱，结果表明HLB柱的回收率最高，11种抗生素的平均回收率为71.4 %～104.0 %。该方法净化效果优于液-液萃取，检测灵敏度高，但是成本较高，需根据检测目的更换不同的吸附剂，且批次间的重复性难以保证。

1.2 QuEChERS方法

QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）方法是Anastassiades教授于2003年开发的一种用于快速测定产品中农药残留量的样品前处理技术[6]，近年在国际上得到了一致认可和广泛应用，其原理与高效液相色谱（HPLC）和SPE相似，都是利用吸附剂与杂质的相互作用，选择性吸附杂质从而达到净化样品的目的。基本步骤是先用乙腈提取分离，再用氯化钠、硫酸镁盐析除去样品中的水和蛋白质，然后再添加SPE填料吸附剂除杂，离心得到的上清可直接进行检测。与传统的SPE相比较，QuEChERS具有耗时少、回收率高、操作简便、准确度高等优点，现已经广泛应用于水果、蔬菜等植物性食品及蜂蜜、牛奶等动物性食品的提取净化。Wang等[7]采用多种优化的QuEChERS方法提取牛奶中的红霉素、青霉素G、盐酸四环素、磺胺甲恶唑、盐酸环丙沙星和青霉素V残留并进行测定，6种抗生素残留的最大回收率均＞80 %，在最佳预处理条件下，最大回收率达84.18 %～115.99 %。Yu等[8]采用QuEChERS方法同时提取多叶蔬菜中的多种抗生素，结果表明该法能有效地从叶类蔬菜中提取所有目标抗生素，20种抗生素的平均回收率为57 %～91 %。虽然QuEChERS方法灵活，但每种抗生物残留的提取都需进行相应的优化（如盐的类型、数量及吸附剂的体积等），才能得到满意的回收率。

1.3 基质固相分散萃取（MSPD）

MSPD方法是将固体、半固体和黏性样品与涂渍有C18等多种聚合物的吸附剂材料一起研磨得到半干的均匀混合物，并将其作为填料装入萃取柱中，然后用不同的溶剂淋洗，将各种目标化合物洗脱下来，目前广泛应用于各种固体和半固体食品中分析物的提取纯化。Sun等[9]制备了一系列新型虚拟分子印迹聚合物（DMIP），作为氟喹诺酮类的高选择性吸附剂，并将制备的DMIP应用于MSPD，从鱼类样品中选择性提取8种氟喹诺酮类抗生素残留，回收率为64.4 %～102.7 %。Bogialli等[10]也在分析奶酪中四环素类抗生素残留的研究中发现，在MSPD技术中，热水是一种有效的萃取剂，其绝对回收率不低于78 %。该方法省去了传统样品前处理中的样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等重复离心、过滤、萃取过程，可直接进行提取和净化，从而缩短整体分析时间并减少萃取溶剂的消耗，也避免了样品的损失，但吸附剂目前不可重复使用。

1.4 加压液体萃取（PLE）

PLE是在较高的温度和压力下用有机溶剂对固体或半固体样品进行萃取的自动化方法，其中升高的温度加速萃取动力学，升高的压力使溶剂的温度保持在其沸点以下。该方法快速、基质影响小、回收率高、重现性好且减少了有毒有机溶剂的用量。Jiménez[11]等分析鸡蛋基质中41种抗生素残留物时，在70 ℃下用乙腈和琥珀酸缓冲液（pH 6.0）混合溶剂（1:1）进行PLE，得到的提取物可直接进行色谱分析。但在大部分食品基质的预处理过程中，PLE后通常还需进一步进行固相萃取。

1.5 微波辅助萃取（MAE）

MAE是利用微波能加热，根据不同物质吸收微波能力的不同将目标化合物从样品中分离出来的一种新型萃取技术。该技术通过微波强化，缩短了提取时间，提高了提取率、降低了成本且减少了溶剂用量，是一种绿色环保的提取技术。但采用MAE对食品基质进行预处理时，常常需要联合SPE等其他技术才能获得干净的提取物。Huang等[12]测定鱼类中6种抗生素残留时采用微波辅助萃取-固相纯化-分散液相微萃取（MAE-SPP-DLLME）进行分离提纯，在最佳条件下，观察到所有目标分析物的良好线性（r＞0.9991）和满意的回收率（回收率＞87 %），与单纯的微波辅助提取和纯化相比，该方法观察到的基质效应明显降低。

总之，从食品基质中提取抗生素残留有多种不同方法，但采用什么方法还需根据具体情况进行判断，不同的食物、不同种类的抗生素采用的方法各有不同。若样本量大且无需准确定量，则首要考虑时间成本，选择操作简便的预处理方法；若是需要对各类抗生素残留准确定量，可能需要联用几种预处理方法，保证各类抗生素残留的有效提取并去除基质效应。

2 抗生物残留的检测方法

检测食品中抗生素残留的分析方法可分为两大类，即筛选方法和确证方法。筛选方法是指能检测分析物或一类分析物的存在并确定其是否符合法规规定的方法[13]，可提供定性、半定量或定量结果，主要用于大量样本的分析，其理想目标是低错误率、高通量、操作简便、分析时间短、选择性好、成本低。确证方法则需准确分析抗生素残留的种类和含量，在定量方面比筛选方法更可靠。目前，筛选方法主要包括薄层色谱法（TLC）、HPLC、毛细管电泳（CE）、生物传感器、微生物测定法和免疫分析法等，确证方法主要为液相色谱-质谱联用法（LC-MS）。

2.1 TLC

TLC是将支持剂涂布于支持板上作为固定相，配制合适的溶剂作为流动相，通过流动相流过固定相时产生重复的吸附、解吸附，对混合样品进行分离、定性鉴别和定量检测的一种层析分离技术。由于其操作简单、适用范围广、速度快、成本低，目前已经成为最受欢迎和广泛使用的抗生素筛选方法之一。但仍存在对于复杂样品分离效能较差、灵敏度较小、不易进行定量分析等缺点。Ramirez等[14]开发了一种通过高效薄层色谱（HPTLC）结合生物自显影技术鉴定和定量牛奶中多种抗生素残留（氯霉素，氨苄西林，苄青霉素，双氯西林和红霉素）的分析方法，回收率为90 %～100 %，该方法的灵敏度较好，保证了上述抗生素的检测水平低于牛奶允许的最大残留限量（MRL），且能减少有机溶剂的使用，大幅降低成本。

2.2 HPLC

HPLC具有“四高一广”的特点：高压、高速、高效、高灵敏度、应用范围广。除此之外，它所需的样品量少，测定精密度高，因此也广泛应用于食品中抗生素残留的筛选和定量。Guo等[15]采用HPLC（C18柱，215 nm检测波长）同时测定牛奶中的克拉维酸和他唑巴坦，均表现出良好的线性（R2＞0.9988），克拉维酸的回收率为81.953 %～87.688 %、RSD为0.975 %～1.248 %，他唑巴坦的回收率为85.007 %～92.991 %、RSD为0.872 %～1.650 %。Khanal等[16]采用快速筛查试剂盒与HPLC分析检测了尼泊尔加德满都谷地鲜奶中的青霉素和磺胺类药物，结果显示液相色谱法精确性和准确性更高，能检测出更多的阳性样品。但采用HPLC进行多种抗生素残留的测定时还需考虑检测器的选择，以大环内酯类抗生素为例，该类抗生素的吸收光谱多在紫外末端区，缺乏特征紫外吸收，不适合采用紫外检测器进行检测，而荧光衍生化易导致红霉素分解，又限制了荧光检测器的应用。因此，在多种抗生素残留的分析中，根据各种抗生素的特征选择合适的检测器对于建立高灵敏度的分析方法至关重要。

2.3 CE

近年，CE已被证明是一种强大的分离技术，通常采用石英作毛细管柱，通过施加高压直流电场，根据分子在电场中的不同迁移来达到分离目的，目前已实现与HPLC相似的灵敏度、选择性和特异性。相对高的效率，快速的分析时间及溶剂和样品的低消耗使CE成为环境友好的检测技术。Dai等[17]建立了一种基于CE和在线化学发光检测（CL），使用Ag（III）络合物作为氧化剂的食品中磺胺类药物残留测定方法，磺胺二甲嘧啶（SDD）、磺胺嘧啶（SDZ）和磺胺噻唑（STZ）的检出限分别为2.75，3.14，0.65 μg/ml，并成功应用于猪肉、鸡肉和牛奶样品中的3种磺胺类药物残留的同时测定。然而，使用CE测定痕量残留物的缺点之一，是由于样品进样体积较小及毛细管上检测的光学路径长度较短，导致其灵敏度较低。

2.4 生物传感器

生物传感器是广泛应用于食品安全、疾病检测、药物发现等多个领域的一种新方法，由两个主要部分组成：生物感受器或生物识别元件及传感器，用于识别目标分析物并将识别事件如分析物浓度转换为可测量的信号。主要包括电化学传感器、光学传感器、重力生物传感器和热传感器。由于其具有特异性高、分析速度快、操作简便、高样品通量且检测限符合法规限制等优点，适用于食品中抗生素残留的筛选。Thompson等[18]开发了一种利用生物传感器技术的筛选方法，用于牛、绵羊和猪的肾中酰胺醇类抗生素甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的检测，均能检测低于其各自1/2 MRL的低浓度。为了达到理想的生物筛选条件，未来还需继续开发更加高效、经济的生物传感器，不仅要提高其灵敏度、特异性，还要结合纳米技术以优化其性能并提供便携性。

2.5 微生物测定法

微生物测定法主要是根据微生物由于抗生素作用表现出的生理机能、代谢、抑制程度等变化来定性、定量地检测出样品内的抗生素残留，具有检测可靠性高、操作便捷、成本低的特点，并存在一定的特异性。Tumini等[19]设计了一种微生物测定法，以短小芽孢杆菌孢子包被微量滴定板，通过观察其微生物抑制情况检测牛奶中四环素的浓度与MRL，通过5 h内指示剂（亮黑色甲苯胺蓝）颜色的变化，检测到117 μg/L金霉素、142 μg/L土霉素和105 μg/L四环素，显示出良好的特异性（97.9 %）。但微生物测定法不能准确定量，且有些实验得到结果耗时长。

2.6 免疫分析法

免疫分析法是基于抗体与抗原或半抗原之间特异性反应建立的一种高选择性生化分析方法，根据标记的不同主要分为荧光免疫分析技术、放射免疫分析技术、酶联免疫分析技术和发光免疫分析技术。由于具有高度灵敏性和高度特异性，大大简化了测量过程，短时间内可检测大量样品，可应用于食品抗生素残留的筛选。Luo等[20]成功开发了一种快速灵敏的化学发光酶免疫测定法（CLIEA）,用于牛奶中新霉素残留分析，样品的平均回收率为88.5 %～105.4 %，检出限为9.4 μg/kg。不过，该方法多用于筛选并判断其是否高于检测限，进一步定量还需依靠LC或LC-MS来进行，且免疫分析法相对容易受到干扰，还存在假阳性、交叉反应性等局限性。

2.7 LC-MS

LC-MS结合了色谱的高分离效能和质谱的定性功能，是迄今为止在任何类型的生物基质中确认抗生素身份的最重要技术。几乎所有的抗生素都是极性和/或热不稳定的化合物，因此采用LC比气相色谱法（GC）更适合。许多国家的公共卫生机构依靠MS检测对食品中的抗生素进行确认，目前多采用电喷雾电离（ESI）或大气压化学电离（APCI）作为离子源。Shendy等[21]采用LC-MS/MS[四级杆复合线性离子阱（QTrap）串联质谱仪，ESI正离子模式]测定蜂蜜中的硝基呋喃代谢物和硝基咪唑的残留量，回收率为90.96 %～104.80 %，重复性和实验室再现性的变异系数（CV）分别为1.35 %～5.10 %和2.65 %～12.58 %，硝基呋喃代谢物的确定限（CCα）和检测容量（CCβ）分别为0.12～0.31 μg/kg和0.21～0.53 μg/kg，而硝基咪唑的CCα和CCβ分别为0.53～0.74 μg/kg和0.91～1.27 μg/kg。Dubreil等[22]采用LC-MS/MS（ESI正离子模式）对肉类和水产养殖产品中75种抗生素进行检测，能鉴定出其中的73种抗生素。LC-MS分离效能强、特异性好、灵敏度高，能同时进行定性和定量测定，是目前比较理想的检测手段。

3 展望

食品中抗生素残留检测的难题在于样品基质的复杂性及检测方法的灵敏度，因此目前研究大多集中于如何优化样品提纯、净化的方法及提高检测方法灵敏度，但这些方法大多都有其局限性。如何有效地改良优化SPE技术，使之能更好地提纯净化食品基质中的抗生素残留是未来一大研究方向，研究重点可放在吸附剂材料的开发上。Ye等[23]合成了一种新型的富含氟、硼的吸附剂（FBA），并将其作为磁性固相萃取的萃取相，这种吸附剂不仅具有较强的磁响应性和较好的使用寿命，且可与HPLCDAD结合，对环境水和牛奶中的痕量氟喹诺酮类抗生素进行灵敏的定量。此外，还可开发多功能吸附剂以简化萃取步骤、提升萃取质量。基质固相分散萃取同样存在吸附剂性能的问题，目前已开发出分子印迹聚合物（MIP）、碳纳米管-分子印迹聚合物（CNT-MIP）、苯基三氧硅烷-氧化镁（PTSMgO）、金属有机骨架（MOF）等多种新型吸附剂，用于各种复杂基质中的特定化合物提取[24]。Wang等[25]合成了一种新型混合模板分子印迹聚合物，可同时识别8种氟喹诺酮类、8种磺胺类和4种四环素类化合物，回收率达92 %以上，并用于建立同时提取猪肉中20种抗生素的基质固相分散萃取方法。目前仍迫切需要开发出具有可重复使用性的吸附剂材料，而磁性纳米颗粒是当前较有希望的可重复使用材料，有待深入研究。另外，生物传感器的应用发展十分迅速，如何提高灵敏度、降低成本、增加便携性以推广应用也是研究的重点。通过不断改进生物感受器（生物识别元件），相信能不断地促进筛选方法的发展，满足检测需要。而色谱技术的不断优化和MS技术的不断发展也为痕量分析提供了强有力的帮助，不断提高食品抗生素残留的定性定量分析水平。