HPLC-MS/MS测定阿齐沙坦在大鼠血浆中的浓度及其药动学研究

刘小雨，常鸿彦，王迎春，徐玲玲，王 芳，刘爱明，逯海燕，戚 敏*

（1. 山东省药学科学院 新药评价中心，山东 济南 250101；2. 山东力诺制药有限公司，山东 济南 250101）

阿齐沙坦是一种血管紧张素II受体拮抗剂，多用于治疗高血压症，可单独使用或与其他降血压药物一起使用，且具有平稳持久降压作用，不会引起干咳[1-3]。阿齐沙坦与两种常用的血管紧张素II受体拮抗剂奥美沙坦、缬沙坦相比，其降压效果有显著的统计学优势[4-5]，且阿齐沙坦还能通过部分激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）对糖尿病患者产生潜在的保护作用[6-9]。阿齐沙坦酯相比于阿齐沙坦胃肠道反应较轻，但进入体内很快转化成阿齐沙坦。鉴于国内外目前关于阿齐沙坦及阿齐沙坦酯的开发研究较多，本文建立了一种灵敏、快速、专属性好的高效液相色谱-质谱联用方法（HPLC-MS/MS）来检测大鼠血浆中阿齐沙坦的浓度，并应用于药动学研究，对阿齐沙坦及其制剂的开发研究具有重要意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AB SCIEX ExionLC-Triple Quad 4500液相质谱联用系统（SCIEX，美国）。包括工作站控制系统，脱气机，ExionLC AC二元高压泵，ExionLC AD Multiplate自动进样器，ExionLC AC柱温箱，Triple Quad 4500系统及Analyst 1.6.3数据采集软件。Z216MK高速冷冻离心机（Hermle，德国）；Advantage A10 Milli-Q超纯水机（Merck，德国）；Vortex Genius 3涡旋仪（IKA，德国）；移液器（Rainin）。

1.2 材料

阿齐沙坦（纯度99.6 %，山东省药学科学院）；缬沙坦（纯度98.0 %，山东省药学科学院）；乙腈（色谱级，Fisher Chemical）；甲酸（色谱级，Fisher Chemical）；超纯水（Advantage A10 Milli-Q超纯水机制备）。

1.3 实验动物

SD大鼠，雄性，18只，体重200～220 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，在温度25 ℃、湿度60 %±5 %条件下饲养一周。随机分成3组，每组6只，分别灌胃给予1，3，9 mg/kg阿齐沙坦。于给药前，药后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h、48 h颈静脉取血0.2 ml，置1.5 ml涂肝素钠的尖底离心管中，8 ℃下8000 r/min离心10 min，取血浆于-80 ℃冰箱中保存。

2 方法与结果

2.1 HPLC-MS/MS条件

色谱条件：Thermo Accucore C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm），流动相为0.1 %甲酸-水（A）与乙腈（B）。洗脱梯度：0～2.5 min，10 %～80 % B；2.6～3.5 min，80 % B；3.6～5.0 min，10 % B；流速：0.50 ml/min；进样量：1.0 μl；柱温：40 ℃。

质谱条件：离子化方式：电喷雾-正离子（Turbo V）；气帘气：35 psi；离子化温度：500 ℃；离子化电压：5500 V；喷雾气：50 psi；辅助加热气：55 psi。监测方式：多反应监测模式（MRM）。阿齐沙坦定量离子对为m/z457.1/279.1，去簇电压110 V，碰撞能量10 eV；内标缬沙坦定量离子对为m/z436.1/291.1，去簇电压130 V，碰撞能量10 eV。

2.2 标准溶液及血浆样品的配制

阿齐沙坦标准溶液：精密称取标准品约10 mg于10 ml量瓶中，加乙腈溶解，配制成浓度为1.0 mg/ml的储备液。分别用70 %乙腈稀释成为0.2，0.5，1.0，2，5，10，20，50，100，200 μg/ml的系列标准曲线工作液及0.6，16，160 μg/ml的质控（QC）标准溶液。

内标标准溶液：精密称取缬沙坦标准品约10 mg于10 ml量瓶中，乙腈溶解，配制成浓度为1.0 mg/ml的储备液。再用乙腈稀释成为1000 ng/ml的内标工作溶液。

血浆样品的制备：分别取0.2，0.5，2.0，5.0，20，50，100，200 μg/ml阿齐沙坦系列工作液10 μl，加入大鼠空白血浆（抗凝剂为肝素钠）90 μl，涡旋混匀，配制成浓度为20，50，200，500，2000，5000，10 000，20 000 ng/ml的系列标准曲线血浆样品。分别取0.2，0.6，16，160 μg/ml阿齐沙坦QC标准溶液10 μl，加入大鼠空白血浆（抗凝剂为肝素钠）90 μl，涡旋混匀，配成浓度为20，60，1600，16 000 ng/ml的阿齐沙坦QC血浆样品。

2.3 血浆样品预处理

取20 μl血浆样品置于1.5 ml离心管中，加入980 μl内标工作溶液，涡旋混匀2 min，13 000 r/min离心5 min，取上清，进样检测。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 取大鼠空白血浆20 μl，加入980 μl乙腈，涡旋混匀2 min，13 000 r/min离心5 min，取上清，进样检测，得空白质谱图（图1A）；取20 μl空白血浆，按2.3项下方法操作，得空白基质含内标质谱图（图1B）；取16 μg/ml的阿齐沙坦标准液10 μl，加空白血浆90 μl，涡旋后取20 μl浓度为1600 ng/ml的含药血浆，按2.3项下方法操作，得阿齐沙坦质谱图（图1C）；取给予大鼠3 mg/kg阿齐沙坦0.5 h的血浆样品20 μl，按2.3项下方法操作，得血浆样品质谱图（图1D）。阿齐沙坦和内标的保留时间分别为2.60 min和2.69 min，内源性物质和内标均不干扰待测物的准确定量。

图1 阿齐沙坦和内标的MRM质谱图

2.4.2 标准曲线 取2.2项下配制的系列标准曲线血浆样品20 μl，按2.3项下操作处理。以阿齐沙坦的浓度为横坐标X，阿齐沙坦与内标物的峰面积比值为纵坐标Y，用加权最小二乘法（权重为1/X2）进行回归运算。回归方程为Y=4.86X-1.33×10-7，r=0.9979。阿齐沙坦在20～20 000 ng/ml范围内线性关系良好。

2.4.3 准确度和精密度 取2.2项下配制的QC血浆样品20 μl，按2.3项下方法操作，每一浓度6个平行样本，3个分析批分3 d进行，以标准曲线回算阿齐沙坦的浓度，并计算其批内和批间准确度和精密度。批内和批间准确度RE在±15 %内，精密度RSD小于15 %。结果见表1。

2.4.4 基质效应与提取回收率 取6只大鼠的空白血浆各20 μl，分别加入980 µl乙腈，涡旋混匀2 min后，8 ℃下、13 000 r/min离心5 min，得空白基质提取液。分别取低（60 ng/ml）、中（1600 ng/ml）、高（16 000 ng/ml）3个浓度的标准溶液20µl，加入内标工作溶液20 µl，加入空白基质提取液960 µl，涡旋混匀后检测，每一浓度6个平行样本，峰面积记为Set1；分别取低（60 ng/ml）、中（1600 ng/ml）、高（16 000 ng/ml）3个浓度的标准溶液20 µl，加入内标工作溶液20 µl，再加入水960µl，进样分析，每一浓度6个平行样本；峰面积记为Set3。以Set1/Set3计算基质效应。通过计算2.4.3项下低、中、高浓度质控（QC）样本中待测物峰面积与Set1中分析物的峰面积比值计算回收率。基质效应与回收率结果见表2。

表1 加样回收试验结果

表2 回收率和基质效应结果（n=6）

2.4.5 稳定性考察 取低、高浓度的阿齐沙坦QC血浆样本20 μl，每一浓度6个平行样本，按2.3项下方法操作，分别考察冻融循环稳定性、室温16 h稳定性、-80 ℃长期放置稳定性和48 h自动进样器稳定性。结果见表3。

表3 阿齐沙坦在不同条件下的稳定性结果（n=6）

2.4.6 稀释效应 取1.0 mg/ml阿齐沙坦浓度储备液10 μl，加入空白血浆90 μl，涡旋混匀，得浓度为100 μg/ml的血浆样本。取10 μl，加入空白血浆90 μl，涡旋混匀，取20 μl，按2.3项下方法操作，平行测定6个样本，其均值的准确度RE为3.9 %，精密度RSD为5.4 %。说明血浆样本经过10倍稀释后不影响准确定量。

2.5 药动学结果

从-80 ℃冰箱取出大鼠血浆样本，室温融化，取20 μl，按2.3项下方法处理（大鼠灌胃9 mg/kg阿齐沙坦后0.25，0.5，1，2 h样品，用大鼠空白血浆稀释10倍后，取20 μl，按2.3项下方法处理），根据随行标准曲线计算阿齐沙坦在大鼠血浆中的浓度。用Phoenix Build 8.1.0.3530计算药动学参数，结果见表4和图2。

SD大鼠灌胃给予1，3，9 mg/kg阿齐沙坦后，Cmax分别为2686，7298，27 999 ng/ml，比值为1:3.8:10.4；AUC0-t分别为22 246，55 460，186 446 h·ng/ml，比值为1:3.4:8.4。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

本研究分别考察了不同的流动相及色谱柱，最后流动相选择0.1 %的甲酸-水和乙腈，峰形好，内源性物质不干扰分析物的准确定量；色谱柱选择Thermo Accucore C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm），该色谱柱具有柱效高、柱压低、分析时间短等优势。

3.2 样本处理

血浆样本处理采用一步蛋白沉淀法，方法简单，易操作，能达到较高的响应且不具有基质效应，能满足高通量分析。血浆样本用量少，灵敏度高，可达到更好的动物福利。

表4 阿齐沙坦药动学参数

图2 大鼠灌胃给予阿齐沙坦后的血药浓度-时间曲线

3.3 采样时间优化

SD大鼠灌胃给药后血浆采集时间选择5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h、48 h。最终结果显示吸收相有2～3个时间点，消除相有4～5个时间点，AUC0-48h/AUC0-∞均大于99.0 %，说明采样时间点选择合理。

3.4 药动学结果

阿齐沙坦在大鼠体内的药动力结果显示，阿齐沙坦在大鼠体内的达峰浓度和暴露量随剂量升高基本成比例增加。阿齐沙坦灌胃给药后在大鼠体内的达峰时间Tmax为0.5～2.0 h，半衰期T1/2为7.3～9.0 h，文献报道[10]健康受试者给予阿齐沙坦40 mg后Tmax为2.0～2.5 h，半衰期T1/2为11 h。结果表明，阿齐沙坦在体内达峰时间快，半衰期长，可提高患者的依从性。

本研究基于HPLC-MS/MS技术建立了大鼠血浆中阿齐沙坦的检测方法并对其进行了验证，该方法能快速准确地进行血中药物浓度检测，且血浆用量少，灵敏度高，重现性好，可用于阿齐沙坦药动学研究。