基于CRISPR/Cas系统的基因敲入技术研究进展

万义彬

（武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430072）

1 基因敲入技术简介

CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Proteins）系统是广泛存在于细菌和古菌中，用于抵抗病毒侵染的免疫防御机制。CRISPR/Cas系统造成的双链断裂会引发细胞内的DNA修复机制以维持细胞的正常存活。最常见的修复机制为同源重组修复（homology-directed repair，HDR）和非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）。基于CRISPR/Cas系统的基因敲入策略即通过提供包含插入序列信息的外源DNA模板（donor DNA），利用细胞内的同源修复机制在Cas蛋白造成的双链断裂位置完成特定序列的敲入。本文通过讨论基因敲入技术的关键影响因素，对效率改进相关的研究进展进行了详细阐述。

2 基因敲入效率的影响因素

基于CRISPR/Cas系统的基因敲入技术由两部分组成。第一部分是CRISPR/Cas系统在确定的靶点处进行切割，产生双链断裂缺口。在这一过程中，CRISPR/Cas系统的切割效率会对基因敲入造成巨大影响，切割后留下的双链缺口的类型也极为重要。第二部分是细胞启动修复机制，以外源donor DNA为同源模板，进行同源修复从而将donor DNA上带有的特定序列插入到靶点缺口处完成基因敲入过程。donor DNA的设计与基因敲入效率息息相关，此外，DNA修复相关的关键基因涉及到细胞对于同源修复途径或者非同源末端连接途径的选择和效率控制，对基因敲入的效率也有极大影响。不仅如此，由于同源修复只发生在细胞周期的S期和G2/M期，细胞周期的调控也十分关键。

3 提高基因敲入效率的策略

3.1 CRISPR/Cas系统改造以提高基因敲入效率。研究发现，包含5’突出末端的双链缺口更有利于同源修复的进行[1]。SpCas9的切割造成的双链缺口是平末端结构，因此，将SpCas9突变为只具备单链切割活性的缺口酶，通过选取合适靶点从而在基因组上产生包含5‘突出末端的粘性末端缺口，其基因敲入效率明显提升。

3.2 同源模板优化以提高基因敲入效率。作为同源修复的模板，donor DNA可以以单链DNA或双链DNA形式存在。双链DNA模板可以是质粒，也可以是双链DNA片段。PCR扩增得到的双链模板为平末端，而内切酶双酶切得到的双链模板为粘性末端。研究发现，后者的效率明显要高[2]。donor DNA的上下游都含有同源臂，与双链切口的上下游序列同源从而介导精准高效的同源重组修复。对于长度为711bp的mCherry基因来说，基因敲入效率随同源臂的加长先提高后降低，600bp的同源臂会产生最高的基因敲入效率[3]。因此，选取合适长度的同源臂能够有效提高基因敲入的效率。

3.3 细胞周期调控以提高基因敲入效率。细胞内双链断裂会引发同源重组修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）。非同源末端连接可在整个细胞周期中发生，而同源重组只发生于S期和G2/M期。使用细胞周期阻滞药物，使得细胞停留在G1/S期或G2/M期，可以显著提高基因敲入效率。Nocodazole等药物可以干扰微管聚合，从而使细胞周期停滞在G2/M期，研究表明，Nocodazole显著提高了同源重组效率[4]。

3.4 DNA修复关键基因调控以提高基因敲入效率。非同源末端连接和同源重组修复通过两条不同的通路完成，但两者是存在相互竞争的。在非同源末端修复过程中，Ku70/Ku80，DNA-PKcs和DNA Ligase IV极为关键。同源重组修复过程则主要依赖于CtIP，RPA和Rad51的功能[5]。药物小分子STL127705，NU7026或SCR7能分别抑制Ku70/Ku80，DNA-PKcs或DNA Ligase IV。小分子 mLN4924，NSC15520或RS-1则能分别对CtIP，RPA或Rad51进行激活。通过单个小分子甚至多个小分子药物对细胞内DNA修复机制产生的综合影响，可以将同源修复效率提高2.3-7.2倍[6]。非同源末端连接（NHEJ）或同源重组修复（HDR）关键基因也可以通过转录调控抑制或激活其表达。这些关键基因的转录激活或抑制同样可以使用CRISPR/Cas系统完成。在靶点位置进行切割的同时对DNA修复的关键基因进行抑制或激活，可以成功地将基因敲入效率提高3-5倍[7]。

4 总结与展望

基于CRISPR/Cas系统的基因敲入策略是突变碱基修复或报告基因插入的重要方法，对于疾病的治疗或者基因定位与功能分析极为关键。通过CRISPR/Cas系统的改造，donor DNA的优化，细胞周期的阻滞以及小分子或转录调控等对关键基因的影响，基因敲入的效率能够得到极大的提高[8]。然而，现有的研究大多数都只在细胞层面进行，极少数进行了小鼠实验，距离基因敲入技术真正应用于疾病治疗等还有很长的路要走。CRISPR/Cas技术本身的脱靶性和免疫原性等问题，以及DNA修复机制的详细细节的研究，都将促使高效而精准的基因敲入技术的产生与进步[9-10]。