白芍总苷对缺血性脑损伤大鼠脑保护作用的研究

王 丽

脑血管病具有高发生率、高致残率和高致死率，流行病学调查显示，脑血管病在世界范围内60岁以上人群中居致死疾病谱第2位，在我国居首位，严重威胁着人类的生命健康[1, 2]。脑血管病患者中约85%为缺血性脑病，即脑血流障碍导致脑组织局部缺血性坏死，其疾病进展过程涉及氧化应激、钙超载、细胞凋亡等多种病理机制[3～6]。白芍总苷(total glucosides of paeony，TGP)是从毛茛科植物芍药的干燥根(中药白芍)中提取的一类活性化合物，包括芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷等，现代药理学研究发现TGP具有良好的抗氧化、抗炎、抑制细胞凋亡等多种药理学作用[7, 8]。本研究将探讨TGP对缺血性脑损伤大鼠脑组织的保护作用。

材料与方法

1.实验动物与分组：240只无特定病原微生物级雄性SD大鼠，7周龄，体质量240±20g，购自河北省实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(冀)2018-004；适应性饲养1周(12h昼夜交替，室温25±1℃)后开展实验。按数字表法随机分为假手术组、模型组、尼莫地平(nimodipine，NMP)10mg/(kg·d)组和TGP 50、100、200mg/(kg·d)组，每组40只。

2.药物与试剂：TGP胶囊(宁波立华制药有限公司，规格0.3克/粒)；NMP胶囊(浙江海力生制药有限公司，规格：20毫克/粒)；伊文思蓝(国药集团化学试剂有限公司)；氧化应激指标试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TUNEL染色试剂盒(北京博奥森生物科技有限公司)。

3.给药与模型制备：(1)给药：精确称取TGP胶囊与NMP胶囊内容物并分别加入适量0.9%氯化钠注射液制备浓度10、20、40mg/ml的TGP溶液和浓度2mg/ml的NMP溶液；TGP 50、100、200mg/(kg·d)组于造模前7天开始分别1次/天给予浓度为10、20、40mg/ml的TGP溶液(5ml/kg)灌胃，NMP 10mg/(kg·d)组给予2mg/ml的NMP溶液灌胃，假手术组和模型组分别同步给予0.9%氯化钠注射液(5ml/kg)。(2)模型制备：参照王新凤等[9]的报道采用线栓堵塞右侧大脑中动脉的方法制备缺血性脑损伤大鼠模型；假手术组除不插入线栓外，其余操作同模型组。造模术后24h行各指标检测。

4.神经功能评估与脑组织BBB通透性检测：(1)每组大鼠随机取10只，由两位经过相关培训的实验人员参照Zausinger等[10]报道的六分法独立进行神经功能评分，取平均值。(2)尾静脉注射4ml/kg伊文思蓝溶液(浓度2%)，1h后麻醉、开胸、由左心室-右心耳通路快速灌注300ml 0.9%氯化钠注射液，断头取右侧大脑，研磨匀浆后加3倍量50%的甲酰胺溶液，60℃孵育24h后3000r/min离心10min取上清液，应用酶标仪检测610nm波长处吸光度值，参照标准曲线计算伊文思蓝含量，伊文思蓝含量可反映BBB通透性。

5.脑组织含水量测定：各组另随机取10只大鼠，麻醉后断头取脑、称量右侧脑组织(W湿)，110℃烘烤至恒重后称重(W干)，含水量(%)=[(W湿-W干)/W湿]×100%

6.脑组织病理学检查和神经细胞凋亡观察：各组另随机取10只大鼠，麻醉后，由左心室-右心耳通路灌注300ml 0.9%氯化钠注射液、300ml 4%多聚甲醛溶液，断头取脑、置4%多聚甲醛溶液固定72h，行石蜡包埋、切片、梯度乙醇脱蜡。行HE染色，梯度乙醇脱水后中性树胶封片，通过光学显微镜观察脑组织病理学改变；按照TUNEL试剂盒操作说明处理，封片后通过光学显微镜观察，凋亡指数(AI)计算：每张切片于缺血区皮质随机选取5个互不重叠的视野计数细胞总数和阳性细胞数，取平均值，AI(%)=(阳性细胞数/细胞总数)×100%。

7.脑组织氧化应激指标检测：取各组剩余10只大鼠，麻醉后断头取脑，于冰上切取右侧大脑、剪碎后加入9倍量4℃冷裂解液研磨匀浆，3000r/min离心10min后取上清液，然后采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性、高锰酸钾滴定法测定CAT活性、硫代巴比妥酸法测定MDA含量。

8.统计学方法：采用SPSS 15.0统计学软件对数据进行统计分析，多组间比较行单因素方差分析，两组间比较行独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.TGP对缺血性脑损伤大鼠神经功能和BBB通透性的影响：与假手术组比较，模型组大鼠Zausinger评分显著降低、伊文思蓝渗透量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，TGP 100、200mg/(kg·d)和NMP 10mg/(kg·d)组Zausinger评分显著升高、伊文思蓝渗透量显著降低(P<0.05)；与NMP 10mg/(kg·d)组比较，TGP 200mg/(kg·d)组Zausinger评分升高且伊文思蓝渗透量降低(P<0.05)，详见表1。

2.TGP对缺血性脑损伤大鼠脑含水量的影响：与假手术组比较，模型组大鼠脑组织含水量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，TGP 100、200mg/(kg·d)和NMP 10mg/(kg·d)组脑组织含水量显著降低(P<0.05)；TGP 200mg/(kg·d)组脑含水量与NMP 10mg/(kg·d)组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

3.TGP对缺血性脑损伤大鼠脑组织病理学改变的影响：假手术组大鼠脑皮质神经细胞形态结构未见异常；模型组大鼠脑组织皮质神经元数量减少、排列疏松、间隙增大、胞核固缩、胞质着色不均匀、出现空泡性改变等病理学改变；TGP 50、100、200mg/(kg·d)和NMP 10mg/(kg·d)组上述病理学改变呈不同程度改善，其中TGP 200mg/(kg·d)组效果相对较优,详见图1。

图1 TGP对缺血性脑损伤大鼠脑组织病理学改变的影响(HE，×200)A.假手术组；B.模型组；C.TGP 50mg/(kg·d)预处理组；D.TGP 100mg/(kg·d)预处理组；E.TGP 200mg/(kg·d)预处理组；F.NMP 10mg/(kg·d)预处理组

4.TGP对缺血性脑损伤大鼠神经细胞凋亡的影响：假手术组大鼠脑皮质仅可见极少量凋亡细胞；模型组神经细胞凋亡数量明显增多，AI显著高于假手术组(49.26%±7.13% vs 2.81%±0.57%，P<0.01)；与模型组比较，TGP 50、100、200mg/(kg·d)和NMP 10mg/(kg·d)组AI显著降低(42.51%±5.60%、34.09%±4.82%、22.58%±3.94%、26.91%±4.16% vs 49.26%±7.13%，P<0.05)；与NMP 10mg/(kg·d)组比较，TGP 200mg/(kg·d)组AI显著降低(22.58%±3.94% vs 26.91%±4.16%，P<0.05)，详见图2。

5.TGP对缺血性脑损伤大鼠脑组织氧化应激的影响：与假手术组比较，模型组大鼠脑组织SOD、CAT活性显著降低且MDA含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，TGP 100、200mg/(kg·d)组和NMP 10mg/(kg·d)组SOD、CAT活性显著升高且MDA含量显著降低(P<0.05)；与NMP 10mg/(kg·d)组比较，TGP 200mg/(kg·d)组SOD活性显著升高且MDA含量显著降低(P<0.05)，详见表2。

图2 TGP预处理对缺血性脑损伤大鼠脑神经细胞凋亡的影响(TUNEL，×200)A.假手术组；B.模型组；C.TGP 50mg/(kg·d)预处理组；D.TGP 100mg/(kg·d)预处理组；E.TGP 200mg/(kg·d)预处理组；F.NMP 10mg/(kg·d)预处理组

讨 论

人大脑重量约占体重的2.5%～3.0%，却约占全身耗氧量的25%，脑缺血5min以上即可出现不可逆损伤，最终致残甚至致死。所以，高危人群预防及发病后及早治疗以减轻缺血早期脑组织损伤对降低病死率、改善预后具有重要意义。病理学研究发现，脑组织供血不足将导致线粒体能量代谢障碍、ATP合成受阻而引发活性氧簇(ROS)大量生成，既往研究发现，通过药物抑制氧化应激对缺血性脑损伤大鼠具有一定的保护作用[11～13]。TGP为中药白芍的主要活性成分，具有良好的抗氧化、抗凋亡作用，本研究结果显示，经TGP预处理能够明显抑制缺血性脑损伤大鼠神经功能缺损，抑制脑组织形态结构病变和神经细胞损伤，抑制神经细胞凋亡，提示TGP对缺血性脑损伤大鼠脑组织具有保护作用。

BBB主要是由内皮细胞结合跨膜蛋白、胞质附着蛋白、骨架蛋白等相互作用形成的三维网状超微结构，能够阻止有害高分子物质由血管进入脑组织，对维持中枢神经内环境稳定具有重要意义[14]。BBB通透性升高是血管源性脑水肿的主要原因，而脑水肿是缺血性脑病致残、致死的重要病理基础[15, 16]。生理状态下伊文思蓝不能通过BBB，但当BBB结构受损、通透性升高时伊文思蓝则可进入脑组织，所以伊文思蓝渗透量能够反映BBB通透性[17]。本研究结果显示，经TGP预处理能够抑制脑组织伊文思蓝含量和含水量的升高，提示TGP对缺血性脑损伤大鼠BBB通透性具有保护作用，对脑水肿具有抑制作用。

脑组织血氧供应不足导致ROS大量生成，以ROS为底物的还原酶SOD、CAT过度消耗，致使ROS过剩而攻击核酸、蛋白质等产生具有细胞毒性的MDA[18]。此外，ROS将攻击细胞骨架，破坏BBB结构导致其通透性升高[19, 20]。本研究结果显示，经TGP预处理能够抑制SOD、CAT活性的降低和MDA含量的升高，提示TGP对缺血性脑损伤大鼠脑组织氧化应激损伤具有抑制作用。

综上所述，TGP对缺血性脑损伤大鼠脑组织具有一定的保护作用，其机制可能与抑制氧化应激、保护BBB通透性、抑制脑水肿有关。