脾瘅宁对糖调节受损大鼠脂肪中NF-κB通路调控作用的实验研究

刘 洋，王 东

（1.辽宁中医药大学，沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110847）

葡萄糖调节受损（Impaired glucose regulation，IGR）即糖尿病前期（pre-diabetes），是代谢正常的人群向糖尿病（DM）转化的中间阶段。有研究显示，中国成年人口中，糖尿病前期患病率为50.1%，且男性多于女性[1]。这近一半人口的数据，使得对糖尿病前期进行干预和药物治疗，越来越成为人们关注的重点。根据2017 年《中国2 型糖尿病防治指南》所述，糖尿病前期属中医脾瘅范畴[2]。过食肥甘致内热中满，导师王东教授从事内分泌临床及基础研究多年，针对内热中满组方脾瘅宁，本研究旨在探讨脾瘅宁对糖调节受损大鼠调节糖、脂代谢的作用机制，为脾瘅宁的临床应用奠定理论基础。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 级Wistar 大鼠100 只，雄性，60～70 日龄，体质量（220±20）g。购自辽宁长生生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2015-0001。购入后，饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，SPF 级动物室，饲养许可证号：SYXK（辽）2013-0009。自由食水，12 h 昼夜节律。

1.2 大鼠饲料 常规饲料：13.4 kJ/g，其中脂肪提供热量占10.2%，蛋白质占23.3%，碳水化合物占66.5%。购于北京华阜康生物技术有限公司。高糖高脂饲料：24.4 kJ/g，其中脂肪提供热量占49.9%，蛋白质占6.2%，碳水化合物占43.7%。购自辽宁中医药大学实验动物中心。

1.3 药品试剂 脾瘅宁由佩兰、党参、黄连等药物组成，中药饮片购自辽宁中医药大学附属医院门诊药局，上述饮片，以蒸馏水500 mL 浸泡1 h，常规煎煮，最终制备成含生药2 g/mL 的中药汤剂，4 ℃保存备用。二甲双胍片，购自中美上海施贵宝制药有限公司，临用时用蒸馏水配成16.7 mg/mL 的混悬液。兔抗大鼠TNF-α、NF-κB 抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司。RT-PCR试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.4 仪器设备 血糖仪：舒霖伴侣GM260，华广生技术股份有限公司；血糖试纸：舒霖伴侣血糖试纸，华广生技术股份有限公司；电泳仪，ES200 型，天能公司生产；垂直电泳槽，EV-180 型，天能公司生产；凝胶成像分析系统，SF4200 型，天能公司生产。

2 实验方法

2.1 实验分组 大鼠适应性饲养1 周后，采用随机数字法，将100 只雄性大鼠随机分为2 组：空白对照组（20 只）和造模组（80 只）。然后对造模组大鼠采用高糖高脂饲料诱导法建立葡萄糖调节受损大鼠模型，模型评价成功后，将造模成功的大鼠再次随机分为模型对照组、脾瘅宁组和二甲双胍对照组。

2.2 模型复制 对造模组大鼠采用高糖高脂饲料诱导法，建立葡萄糖调节受损模型。造模组大鼠给予高糖高脂饲料喂养，自由进食水，室温控制在18～20 ℃，相对湿度30%～70%。连续喂养12 周。空白对照组大鼠以常规饲料喂养。

2.3 模型评价

2.3.1 评价方法 12 周后进行糖耐量实验（OGTT）：禁食8 h 后鼠尾采血用快速血糖仪测空腹血糖（FBG），以50%葡萄糖注射液2 g/kg 体质量灌胃，2 h 后再次鼠尾采血测餐后血糖（2 hPG）。

2.3.2 成模标准 计算空白对照组大鼠空腹血糖及OGTT 2 hPG 参考值范围（空腹血糖：空白对照组大鼠平均FBG1.96S,OGTT 2 hPG：空白对照组大鼠平均2 hPG1.96S,S：空白对照组大鼠空腹血糖及2 hPG 的标准差）。以空白对照组大鼠血糖为标准，造模组以FBG 或2 hPG 高于空白对照组相应血糖值上线（空腹血糖：空白对照组大鼠平均FBG+1.96S,OGTT 2 hPG：空白对照组大鼠平均2 hPG+1.96S），并且FBG ＜7.0 mmol/L、OGTT 2 hPG ＜11.1 mmol/L 以及任意时间血糖＜16.7mmol/L 的大鼠为建模成功[3]。

2.4 干预方法 模型评价后，共计造模成功43 只，将造模成功的大鼠随机分为3 组：模型对照组（14只）、脾瘅宁组（15 只）、二甲双胍对照组（14 只）。空白对照组：5 mL/（kg·d）蒸馏水灌胃，每日1 次，连续4 周。模型对照组：5 mL/（kg·d）蒸馏水灌胃，每日1 次，连续4 周。脾瘅宁组： 10 g/（kg·d）脾瘅宁汤剂灌胃，每日1 次，连续4 周。二甲双胍对照组：150 mg/(kg·d)二甲双胍悬液灌胃，每日1次，连续4周。

2.5 样本采集 末次给药后1 h，各组大鼠经尾尖采血，测定血糖。然后以过量麻醉法处死大鼠，置于冰面上，剖开下腹部，采集附睾周围的脂肪组织，置于2 mL 冻存管中，于-70 ℃冰箱中冻存，其中随机抽取6 例样本用于RT-PCR 检测，再随机抽取6 例样本用于western-blot 检测。

2.6 指标检测

2.6.1 血糖 造模后大鼠进行糖耐量试验。分别于给药前和末次给药后1 h，断尾采血，用舒霖伴侣GM260 血糖仪和血糖试纸测定血糖。

2.6.2 脂肪组织中TNF-α、NF-κB mRNA 的表达 采用RT-PCR 法检测各组大鼠脂肪组织中TNF-α、NFκB mRNA 的表达。Trizol 抽提法提取脂肪组织中总RNA，测定浓度及质量后，采用一步法RT-PCR 试剂盒，以β-actin 为内参，对TNF-α、NF-κB 相应引物进行扩增，引物序列详见表1。扩增产物与1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像分析系统中采集图像，并测定目的基因和内参基因扩增条带的积分光密度值，并以目的基因积分光密度值/内参基因积分光密度值的比值作为该例样本目的基因的相对表达水平，进行统学分析。

表1 引物序列表

2.6.3 脂肪组织中TNF-α、NF-κB 蛋白的表达 采用western-blot 法检测各组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB的表达。采用裂解法提取脂肪组织中总蛋白，蛋白定量后，加入loading buffer，沸水浴5 min，以30 μg/孔的蛋白量进行上样电泳，湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，一抗（1:200）4 ℃孵育过夜，二抗（1:1 000）室温孵育2 h，洗膜后置于凝胶成像分析系统中，滴加ECL 工作液，曝光60 s，采集图像，并测定目的蛋白和内参蛋白条带的灰度值，以目的蛋白灰度值/内参条带灰度值的比值作为该例样本目的蛋白的相对表达水平，进行统计学分析。

2.7 统计学方法 各组实验数据应用 SPSS 16.0 统计软件包进行统计学分析，计量资料均以均数±标准差（）表示，2 组间比较采用t检验，3 组及以上组间比较采用单因素方差分析（One way-ANOVA）。

3 结果

3.1 模型评价 造模后，空白对照大鼠FBG 为4.54 mmol/L，2 hPG 为6.73 mmol/L。因此空白大鼠FBG+1.96S 为6.5 mmol/L，2 hPG+1.96 S 为8.69 mmol/L。测得各组FBG 及2 hPG 结果后，符合FBG 高于6.5 mmol/L，低于7.0 mmol/L；OGTT 2 hPG 高于8.69 mmol/L，低于11.1 mmol/L；随机血糖低于16.7 mmol/L 的大鼠共计43 只[4]。

3.2 用药前及用药后各组大鼠体质量比较 见表2。

表2 用药前及用药后各组大鼠体质量比较（） g

表2 用药前及用药后各组大鼠体质量比较（） g

注：与空白对照组比较，## P ＜0.01；与模型对照组比较，△△P ＜0.01

3.3 用药前各组大鼠FBG、2 hPG 比较 各组大鼠给药前及给药后血糖检测结果显示：给药前，模型对照组、脾瘅宁组及二甲双胍对照组大鼠空腹血糖及OGTT2 h 血糖均显著高于空白对照组，有统计学差异（P＜0.01）；而模型对照组、脾瘅宁组及二甲双胍对照组3 组大鼠的空腹血糖及OGTT2 h 血糖无显著性差异（P＞0.05）。给药后，与模型对照组比较，脾瘅宁组及二甲双胍对照组大鼠空腹血糖均显著降低（P＜0.05 或0.01），但脾瘅宁组大鼠空腹血糖高于正常对照组（P＜0.01），二甲双胍对照组大鼠与空白对照组大鼠空腹血糖无显著性差异（P＞0.05），见表3。

表3 用药前各组大鼠FBG、2 hPG 比较（） mmol/L

表3 用药前各组大鼠FBG、2 hPG 比较（） mmol/L

注：与空白对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与模型对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与脾瘅宁组比较，▲P ＜0.05

3.4 TNF-α、NF-κB mRNA 表达水平 各组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB mRNA 表达检测结果显示：与空白对照组比较，模型对照组、脾瘅宁组和二甲双胍对照组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB mRNA 的表达水平均显著上调，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型对照组比较，脾瘅宁组和二甲双胍对照组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB mRNA 的表达水平均显著下调，差异有统计学意义（P＜0.01）；脾瘅宁组与二甲双胍对照组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB mRNA表达水平无显著性差异（P＞0.05），见表4，图1。

表4 各组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB mRNA 表达水平（，n =6）

表4 各组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB mRNA 表达水平（，n =6）

注：与空白对照组比较，## P ＜0.01；与模型对照组比较，△△P ＜0.01

图1 各组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB mRNA 表达电泳图

3.5 TNF-α、NF-κB 蛋白表达水平 见表5，图2。

表5 各组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB 蛋白表达水平（，n =6）

表5 各组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB 蛋白表达水平（，n =6）

注：与空白对照组比较，## P ＜0.01；与模型对照组比较，△△P ＜0.01

图2 各组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB 表达曝光照片

4 讨论

《素问·奇病论》曰：“有病口甘者，病名为何，何以得之?岐伯曰：此五气之溢也，名曰脾瘅。”知其症状为口甘，病位在脾。内经认为其病机为内热中满，用一味兰草汤，除陈解郁以疗之。古籍记载以及近代的文献报道表明，脾瘅应属于中医消渴病的前期阶段，糖尿病患者从早期的无明显症状到有口渴或善饥等症状之前这一阶段,均属于中医的“脾瘅”范畴[5-6]。脾瘅宁就是针对该病理阶段证型特征而拟定的治疗糖尿病前期，葡萄糖调节受损阶段的中药方剂。脾瘅宁方由佩兰、苍术、党参、黄精、黄芪、黄连、大黄、茯苓、泽泻、葛根组成，以“治未病”为理论基础[7-8]，以“脾主运化”为主要治则[9]。

葡萄糖调节受损即糖尿病前期，包括空腹血糖受损和糖耐量减低，是2 型糖尿病的高危人群。报道显示，适当干预该阶段患者，可有效预防2 型糖尿病的发生和发展[10-11]。因此，出于对2 型糖尿病的预防，IGR已经受到了众多临床及基础研究人员的高度重视。2 型糖尿病是由于胰腺功能出现障碍或胰岛素分泌缺陷，机体糖、蛋白质、脂肪调节功能受损，以高血糖为特征的一种常见代谢性疾病。研究表明，炎症反应机制是机体发生胰岛素抵抗的主要原因之一[12]，TNF-α 等炎性因子通过多重路径减少胰岛素介导的葡萄糖和脂肪转运，从而诱发胰岛素抵抗，进而发展为糖尿病[13]。而NF-κB 信号通路是介导炎症反应的主要信号通路之一，报道表明，TNF-α、IL-6 均受到了NF-κB 信号的调控[14-19]。同时，过表达的TNF-α 等炎性因子又导致了NF-κB 信号通路的激活，从而循环重复加重炎症反应的发生，最终导致了糖、蛋白质、脂肪代谢的异常，发生糖尿病。因此，调控TNF-α/NF-κB 途径成为糖尿病防治的重要靶点[20-21]。

本研究采用高糖高脂喂养法诱导糖调节受损的大鼠模型，模型评价结果显示：造模后，以空白对照大鼠FBG 和2 hPG 的上限6.5 mmol/L 和8.69 mmol/L 为标准，符合FBG 高于6.5 mmol/L，低于7.0 mmol/L；OGTT 2 hPG 高于8.69 mmol/L，低于11.1mmol/L；随机血糖低于16.7 mmol/L 的大鼠共计43 只，造模成功率仅为54%。分析成功率低的原因：糖调节受损状态为糖耐量异常阶段，该阶段临床诊断标准对血糖值要求严格，为了更贴切的模拟临床糖调节受损患者的基本状态，我们在本次研究中，严格按照临床糖耐量异常的标准对模型进行筛选。尽管模型成功率不高，但是通过高糖高脂饲料连续喂养12 周的方案，可复制出稳定的葡萄糖调节受损大鼠模型。

脾瘅宁干预后，体质量及血糖检测结果表明，脾瘅宁可显著降低糖调节受损模型大鼠的体质量，提示脾瘅宁可能具有调节脂代谢的作用。此外，脾瘅宁还可以降低糖调节受损模型大鼠空腹血糖和餐后2 h 血糖，尤其是餐后2 h 血糖，其作用于二甲双胍相当。提示脾瘅宁具有调节血糖作用。但其调节脂代谢和血糖的作用机制尚不能确定。

因此，我们继续进行了相关机制研究。对各组大鼠附睾周围脂肪组织中TNF-α、NF-κB mRNA 及蛋白表达水平进行了检测。结果表明：与空白对照组比较，模型对照组、脾瘅宁组和二甲双胍对照组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB mRNA 及蛋白的表达水平均显著上调。提示在糖尿病早期，糖调节受损阶段，机体内介导慢性炎症的信号已经开启。脂肪组织中慢性炎症的发生可能是脂代谢异常的作用机制之一。与模型对照组比较，脾瘅宁组和二甲双胍对照组大鼠脂肪组织中TNF-α、NF-κB mRNA及蛋白的表达水平均显著下调，提示脾瘅宁与二甲双胍具有抑制糖调节受损大鼠脂肪组织中慢性炎症的作用，但二者作用机制不同。二甲双胍的抑制促炎因子及促进抗炎因子表达的机制是多通路，多途径的[22]。而脾瘅宁的作用机制尚不明确。本研究显示，脾瘅宁可有效抑制糖调节受损大鼠脂肪组织中TNF-α 和NF-κB mRNA 及蛋白的表达水平，提示我们脾瘅宁抑制NF-κB 信号通路的过度活化作用可能是其抑制慢性炎症反应，调节脂代谢和糖代谢的作用机制之一。

综上所述，脾瘅宁具有与二甲双胍相类似的调节体质量（脂肪代谢）、血糖、餐后2 h 血糖的作用。抑制TNF-α、NF-κB 过表达可能是其作用机制之一。