干扰长链非编码RNA AFAP1-AS1抑制人鼻咽癌HNE2细胞增殖、侵袭及体内移植瘤形成的研究①

谢天飞 王凌云 刘 丽 桑建中

(河南医学高等专科学校耳鼻咽喉科，郑州 451191)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种恶性程度较高的头颈部肿瘤，其中、晚期多采用放疗辅以化疗治疗，但5年生存率依然不足50%[1]。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是目前研究较多的一类参与肿瘤细胞增殖、迁移、转移及复发等进程的无蛋白质编码功能的RNA分子[2]。肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1(actin filament associated protein 1-antisense RNA1，AFAP1-AS1)作为lncRNA的一员，通过改变肌动蛋白丝及微丝的完整性调控细胞的吞噬运动[3]。目前，针对AFAP1-AS1的研究表明，其在肿瘤中表达量明显高于正常组织，表明AFAP1-AS1高表达与肿瘤的发生发展相关，但其参与肿瘤相关进程的具体作用机制尚不清楚[4，5]。本研究通过短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰AFAP1-AS1并转染人鼻咽癌HNE2细胞进行体外细胞与体内裸鼠移植瘤试验，探索AFAP1-AS1干扰对NPC的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 5周龄SPF级雄性BALB/c裸鼠10只，体质量(16.37±1.07)g，购自北京阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0009]，所有BALB/c裸鼠均饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所屏障环境动物房[SYXK(京)2015-0035]。

1.1.2细胞来源 NPC细胞HNE2购自中国科学院上海细胞生物所。

1.1.3主要试剂 胎牛血清(FBS)、RPMI1640培养液购自Gibco公司；lncRNA AFAP1-AS1-shRNA、NC-shRNA购自上海吉凯基因技术有限公司；脂质体、Lipofectamine®2000购自Thermo Fisher Scienti-fic；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth pactor,VEGF)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、β-actin抗体以及抗小鼠/兔IgG购自美国Santa Cruz公司；PCR试剂盒购自美国Promega公司；所有引物由上海生工合成。

1.1.4主要仪器 TDL-4台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；IX51倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；RI-6000酶标分析仪(美国雷杜公司)；FACS Canto Ⅱ 流式细胞仪(美国BD公司)；Image Master VDS凝胶自动成像仪(瑞典Pharmacia公司)。

1.2方法

1.2.1细胞悬液的制备 NPC细胞HNE2培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素或链霉素的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养至对数期，生理盐水漂洗后，0.25%胰蛋白酶消化液处理2 min后弃除胰蛋白酶，加入完全培养基洗脱细胞制成细胞悬液。

1.2.2细胞转染实验 将培养好的细胞悬液分为空白对照组(Control)、阴性对照组(shRNA-NC)与lncRNA AFAP1-AS1干扰组(sh-AFAP1-AS1)用于后续含有目的片段质粒转染，参照试剂盒说明操作并采用Lipofectamine®2000将lncRNA AFAP1-AS1稳定下调的质粒转染于sh-AFAP1-AS1组细胞，含无义序列shRNA的质粒转染于shRNA-NC组细胞，继续培养48 h后置于荧光显微镜下观察转染阳性细胞，若发出绿色荧光则视为转染阳性，收集细胞用于RT-PCR检测各组细胞AFAP1-AS1表达水平。

1.2.3结晶紫染色检测细胞增殖 将转染后的各组细胞悬液调整密度至1×104个/ml，接种于24孔板，100 μl/孔，每组3个复孔，培养24 h后弃上层培养液，PBS清洗2次后加入0.25%结晶紫溶液，200 μl/孔，常温下染色20 min后，弃去结晶紫溶液，PBS清洗24孔板，重复3次后进行风干处理，用20%甲醛溶液完全溶解，酶标仪(490 nm)定量分析。重复试验3次。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 将各组细胞悬液密度调整为4×104个/ml，接种于6孔板、400 μl/孔，每组3个复孔，培养48 h后收集各组细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS清洗2遍，弃上清液，加入试剂盒中的缓冲液，混匀，再加入5 μl Annex-inV/FITC、10 μl PI混合，室温避光孵育15 min，用于流式细胞仪检测。CellQuest软件分析计算细胞凋亡率。重复试验3次。

1.2.5Transwell小室体外侵袭实验 待鼠成纤维细胞NIH3T3生长至80%融合时，PBS清洗细胞，置于无胎牛血清的RPMI1640中继续培养24 h，培养过程中每100 ml培养瓶中加入6 ml无胎牛血清RPMI1640培养液，取上清液备用。将Transwell小室置于24孔板，40 μl基质胶(Matrigel)平铺于小室滤膜，经紫外线过夜消毒后，用少量无胎牛血清RPMI1640培养液浸润上室。在上室中分别加入400 μl密度为2×105个/ml的各组细胞悬液，下室中添加600 μl的NIH3T3上清液。每组细胞设置3个复孔，继续培养24 h后取出小室，利用棉签轻柔的擦去上层未穿膜的细胞和基质胶，冰甲醛固定滤膜后染色。将滤膜剥离后正面朝下固定于载玻片，光学显微镜下随机选择5个高倍镜(×400)视野，统计各视野的平均穿膜细胞数。重复试验3次。

1.2.6Western blot检测各组细胞中VEGF、MMP-9、PCAN蛋白表达水平 提取培养48 h的各组细胞总蛋白，采用Bradford调整各组蛋白浓度一致，经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至甲醛处理过预处理过的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人VEGF、MMP-9、PCAN、β-actin一抗(1∶500)4℃孵育过夜，TBST漂洗40 min，加入HRP标记的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL试剂盒与DNR BioImaging System观察膜上蛋白条带，收集影像，采用凝胶图像处理系统软件分析各组条带灰度值，依据相对灰度值进行统计学分析。重复试验3次。

1.2.7重组质粒对裸鼠移植瘤的作用 将裸鼠随机分为Control组与sh-AFAP1-AS1组，每组5只。将目的质粒与脂质体(1∶3)混合，质粒最终浓度为0.5 mg/ml，收集对数生长期的HNE2细胞，以1×108/ml 细胞悬液注射于裸鼠右腋下，Control组注射shRNA-NC，肿瘤直径大于5 mm时则成为移植瘤标准，饲养2周后处死裸鼠，分离肿瘤并测定肿瘤质量，并将一部分肿瘤组织置于4%甲醛溶液中固定，用于免疫组织观察VEGF表达水平；另一部分肿瘤组织置于-80℃存储，用于RT-PCR与Western blot检测2组肿瘤组织中AFAP1-AS1表达水平。2组裸鼠试验期间均在培育室饲养，温度20℃～25℃，湿度50%～55%，人工光照(12 h/昼、12 h/夜)，裸鼠全天自由饮水与饮食。

1.2.8免疫组化与TUNEL法检测细胞凋亡

1.2.8.1免疫组化法 将肿瘤组织进行常规石蜡切片，脱水、PBS溶液漂洗、3% H2O2与甲醇混合液浸泡10 min，超纯水漂洗、抗原修复、PBS漂洗5 min、加入一抗37℃反应2 h、PBS漂洗5 min、加入二抗37℃反应40 min、PBS漂洗5 min、DAB室温显色20～30 min，镜检观察有棕黄色颗粒出现时采用自来水终止。苏木素复染30 s、自来水漂洗、中性树胶封片，光镜下观察细胞样本中VEGF的阳性表达细胞，其细胞浆表现为棕黄色颗粒。每张标本选取视野10个(×400)，统计阳性细胞数，以计算阳性细胞率，阳性细胞率(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.8.2TUNEL法 取各组裸鼠移植瘤组织进行常规石蜡包埋，参考免疫组织化学试剂盒说明书操作，于显微镜下观察并采集图像。随机选取5个视野，记录200个细胞中阳性细胞数，细胞凋亡情况运用末端标记技术TUNEL法检测并以TUNEL指数表示。细胞核呈棕黄色者视为凋亡细胞。

1.2.9RT-PCR检测各组细胞中AFAP1-AS1相对表达水平 采用TRIzol试剂提取组织及细胞总RNA，并反转录为cDNA，SYBR-Green PCR Mix 检测mRNA表达水平。PCR参数设置：95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环。引物信息如下：GAPDH内参基因，F：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，R：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′；AFAP1-AS1，F：5′-ACTGAAGAGGAACCAGGGACAG-3′，R：5′-GGGGAAACTGAAATGAATGAAG-3′；应用qPCR和2-ΔΔCt法分析相关基因表达数据。

2 结果

2.1AFAP1-AS1促进HNE2细胞增殖 RT-PCR结果显示，sh-AFAP1-AS1组HNE2细胞中AFAP1-AS1表达水平显著低于Control组(P<0.05)，而shRNA-NC组HNE2细胞中AFAP1-AS1表达量与Control组差异无统计学意义(P>0.05，图1A)；结晶紫染色结果显示，sh-AFAP1-AS1组HNE2细胞增殖率显著低于Control组(P<0.05)，而shRNA-NC组HNE2细胞增殖率与Control组差异无统计学意义(P>0.05)，见图1B、C。

2.2AFAP1-AS1抑制HNE2细胞凋亡 FCM检测结果显示，sh-AFAP1-AS1组HNE2细胞凋亡率显著高于Control组(P<0.05)，而shRNA-NC组HNE2细胞凋亡率与Control组差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.3AFAP1-AS1促进HNE2细胞侵袭转移 Transwell结果显示，sh-AFAP1-AS1组HNE2细胞侵袭率显著低于Control组(P<0.05)，而shRNA-NC组HNE2细胞侵袭率与Control差异无统计学意义(P>0.05)，见图3A；Western blot结果显示，sh-AFAP1-AS1组HNE2细胞中VEGF、MMP-9蛋白水平显著低于Control组(P<0.05)，而shRNA-NC组HNE2 细胞中VEGF、 MMP-9 蛋白含量与 Control 组差异无统计学意义(P>0.05)，见图3B。

图1 AFAP1-AS1促进HNE2细胞增殖

图2 AFAP1-AS1抑制HNE2细胞凋亡Fig.2 AFAP1-AS1 inhibits apoptosis of HNE2 cellsNote:Compared with Control,*.P<0.05.

图3 AFAP1-AS1促进HNE2细胞侵袭(×400)

2.4AFAP1-AS1影响体内HNE2肿瘤形成 将sh-FAP1-AS1组高浓度HNE2细胞悬液注入裸鼠右腋下以建立移植瘤模型，结果显示，sh-AFAP1-AS1组裸鼠肿瘤中的AFAP1-AS1表达水平显著低于Control组(P<0.05)， 见图4A；sh-AFAP1-AS1组裸鼠肿瘤质量显著低于Control组(P<0.05)，见图4B。sh-AFAP1-AS1组裸鼠肿瘤组织中的细胞凋亡率显著高于Control组(P<0.05)，见图5A；免疫组化检测结果显示，sh-AFAP1-AS1组裸鼠肿瘤组织中VEGF阳性表达率显著低于Control组(P<0.05)，见图5B。

图4 AFAP1-AS1影响体内HNE2肿瘤的形成

图5 AFAP1-AS1对细胞凋亡率及VEGF蛋白的影响(×400)

3 讨论

AFAP1是一类肌动纤维相关蛋白，能够通过与肌动蛋白及 Src家族蛋白或其他通路蛋白结合， 改变微丝的完整性，调控细胞的吞噬运动，从而参与肿瘤细胞的侵袭及转移[6,7]。AFAP1-AS1作为AFAP1的反义链，是目前研究较多的一种lncRNA，主要在转录后水平对AFAP1进行调控，从而参与肿瘤的发生发展过程[8]。虽然目前有很多关于AFAP1-AS1在肿瘤过程中的研究，但其具体作用机制尚不明确。课题组通过shRNA干扰AFAP1-AS1并转染至NPC HNE2细胞系中发现，抑制AFAP1-AS1表达后，HNE2细胞的增殖及侵袭能力降低，凋亡增强，表明在NPC细胞中，AFAP1-AS1可能是作为促癌基因参与肿瘤的发生发展过程。Luo等[9]检测食管鳞状细胞癌患者瘤组织中AFAP1-AS1表达发现，其表达量较正常组织显著上调，AFAP1-AS1高表达量与肿瘤大小、临床TNM显著相关；体外实验证实，AFAP1-AS1能够促进食管鳞状细胞癌细胞增殖，AFAP1-AS1高表达患者总体生存率降低。Lu等[10]研究发现，AFAP1-AS1在肝癌组织中高表达，沉默AFAP1-AS1后，Ki-67、Bcl-2、MMP-9基因表达下调，Bax表达上调，表明AFAP1-AS1能够抑制细胞凋亡。Zhang等[11]通过敲除肝癌细胞中AFAP1-AS1发现，RhoA和Rac2表达下调，提示AFAP1-AS1可能通过调控RhoA/Rac2家族蛋白通路参与肿瘤的发生发展过程。癌细胞的恶性增殖是其发展的重要基础，而促癌基因通过促进细胞的增殖及分裂，从而加速肿瘤的发展，同时，促癌基因还会抑制细胞凋亡过程进一步促进肿瘤细胞发展[12,13]。本研究于既往研究结果相符，提示在上述恶性肿瘤中，AFAP1-AS1可能是作为一种促癌基因来调控肿瘤细胞增殖及凋亡过程。

浸润和转移是肿瘤的两大恶性特征，肿瘤转移受很多过程调控。VEGF能够特异性的诱导血管内皮细胞发生分裂增生，还能够增加血管的通透性，其功能的多样性与下游的络氨酸激酶受体种类相关[14]。肿瘤的生长离不开血管新生，肿瘤的血管功能及结构与正常血管不同，多半是畸形的，容易诱发局部组织缺氧，进一步刺激VEGF的合成，导致肿瘤细胞浸入血管进而向淋巴及远处细胞侵袭转移[15]。MMPs是间质细胞的标志蛋白之一，是上皮间质转化的诱发因素之一，MMP-9主要是通过降解细胞外基质，从而使肿瘤细胞更容易转移[16，17]。本研究发现，抑制AFAP1-AS1表达后VEGF和MMP-9蛋白表达均显著降低，表明AFAP1-AS1除了通过转录水平调控AFAP1蛋白相关途径影响细胞运动外，还能通过增强血管通透性及上皮间质转化过程调控细胞侵袭。付丛等[18]分析表明，AFAP1-AS1能够参与多种肿瘤的侵袭和转移过程，可能是通过解除肌动蛋白纤维的完整性，增强肿瘤细胞的黏附迁移来完成肿瘤转移。课题组结合既往研究结果推测AFAP1-AS1调控肿瘤细胞侵袭转移可能的机制：一方面在转录后水平调控AFAP1表达改变微丝完整性，让细胞形态发生变化；另一方面通过调控VEGF和MMP-9表达，促进肿瘤细胞血管的生长和上皮间质转化，改变血管的通透性同时使细胞去极化，为肿瘤细胞提供更容易转移及浸润的条件。

为了进一步研究AFAP1-AS1的功能，课题组利用裸鼠进行了异体移植实验，结果显示，抑制AFAP1-AS1表达后，肿瘤的质量显著降低，提示AFAP1-AS1能够促进肿瘤生长，其机制可能是通过促进肿瘤组织中VEGF的表达来促进血管生成，从而促进肿瘤的生长。Bo等[19]通过cDNA芯片技术构建了lncRNA的表达谱，发现AFAP1-AS1表达量在NPC组织中显著升高，体外实验发现，转染sh-AFAP1-AS1后NPC细胞的侵袭和迁徙能力较明显减弱，裸鼠异体实验与体外实验结果一致，表明AFAP1-AS1能够促进NPC细胞的侵袭和迁徙。Ma等[20]通过研究AFAP1-AS1的表达发现，AFAP1-AS1能够下调Twist1和Vimentin表达，上调E-cadherin表达，抑制胆囊细胞的上皮间质的转化过程，抑制细胞的迁徙。与前人结果相一致，证实了AFAP1-AS1能够促进细胞的侵袭和转移。

综上所述，AFAP1-AS1能够显著促进NPC细胞增殖，抑制细胞凋亡，并通过促进VEGF和MMP-9蛋白表达促进NPC细胞的迁移和侵袭。进一步证实AFAP1-AS1可能作为NPC抗侵袭和转移基因治疗的潜在靶基因。