抗人妊娠相关血浆蛋白A单抗的制备、鉴定及化学发光和胶体金检测体系的建立①

张兰兰 于 洋 曹领改 魏德强

(东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040)

人妊娠相关血浆蛋白A(proteinase pregnancy-associated plasma protein A，PAPP-A)是一种锌结合金属糖蛋白由胎盘分泌并直接进入母体血液循环[1，2]。从胚泡着床期开始，PAPP-A的浓度一直升高直至妊娠结束。PAPP-A是唐氏综合征(down syndrome，DS)筛查的主要标志物之一，应在妊娠11～14周进行定量筛查[3]。在妊娠期间，循环的PAPP-A通过二硫键结合嗜酸性主要碱性蛋白(proMBP)形成异源四聚体(2:2)，即PAPP-A/ProMBP，分子量约为500 kD，PAPP-A单体的分子量约为200 kD[4]。与PAPP-A一样，proMBP在妊娠期间在胎盘中合成，但其在妊娠过程中的作用尚未阐明。

孕妇血清PAPP-A水平与不良妊娠结果有关，如妊娠糖尿病、子痫前期、胎儿染色体异常、胎儿宫内生长受限、低出生体重、死产和早产[5-11]；在心血管疾病方面，PAPP-A亦可作为动脉粥样硬化斑块稳定程度的标志物[12,13]；研究发现，PAPP-A能够特异性地切割3种胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)[14,15]：IGFBP-2、IGFBP-4和IGFBP-5，其与细胞表面的糖胺聚糖紧密结合，在组织内起促进生长的酶的作用，在靠近IGF受体的位置释放具有生物活性的IGF，且其是一种依赖胶原蛋白的原癌基因，所以PAPP-A可能作为肿瘤标志物或癌症高差异表达的治疗靶点[16-18]。Oncomine数据库显示PAPP-A在多种癌症中高表达，见图1。

本研究通过细胞融合技术结合高通量筛选的方法获得可分泌高亲和性、高特异性、高效价及高产量的抗PAPP-A杂交瘤细胞株，为双抗体夹心检测PAPP-A化学发光试剂盒及胶体金试纸条的研制和开发提供优良材料。同时通过对试剂盒分析性能的评估为 PAPP-A检测试剂盒的临床应用及国产化奠

图1 PAPP-A在不同类型癌症中的转录水平(Oncomine)Fig.1 Transcription levels of PAPP-A in different types of cancers (Oncomine)

定基础。

1 材料与方法

1.1材料 小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、无血清培养基MD6和羊抗鼠 IgG由东北林业大学大庆生命技术研究院提供；A/J小鼠，雄性，6～8周龄，购于中国农科院哈尔滨兽医研究所；PAPP-A、AFP、PRL、hPL和HCG蛋白抗原均购于美国Fitzgerald公司；弗氏佐剂 、红细胞裂解液、PEG2000、HAT 、HT、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白A(protein A)、HRP、鲁米诺试剂均购于Sigma 公司；硝酸纤维素膜、玻璃纤维、聚酯纤维、吸水纸及背板购于上海金标公司；氯金酸、柠檬酸钠及其他试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。BHP9504化学发光分析仪购自北京滨松光子技术股份有限公司；加样仪、洗板机及酶标仪均购自美国BioTEK公司。

1.2方法

1.2.1动物免疫 取PAPP-A抗原及少量脂蛋白与弗氏佐剂乳化，乳化完全后免疫A/J小鼠，抗原免疫量为25 μg/只，每隔2周进行第2次和第3次免疫。第3次免疫后第8天取小鼠尾部血清，间接ELISA法检测血清效价，选择效价在1∶10 000以上的小鼠无菌取脾进行细胞融合。

1.2.2细胞融合与筛选 取小鼠脾细胞采用PEG2000方法使其与SP2/0细胞进行融合，用HAT培养基对杂交瘤细胞进行选择培养，筛选出已融合的杂交瘤细胞进行培养。培养10天后吸取细胞上清，ELISA法进行筛选，对阳性细胞株做多次亚克隆获得可稳定分泌抗PAPP-A单抗的细胞株。

1.2.3mAb纯化 将筛选得到的抗PAPP-A细胞株用转瓶进行扩大培养，当转瓶中90 %以上的细胞死亡后离心收取上清，0.45 μm滤膜过滤，采用protein A亲和层析方法进行抗体纯化，获得抗PAPP-A单抗，透析浓缩，-20℃储存。

1.2.4mAb鉴定 BCA法测定抗体浓度。SDS-PAGE测定抗体纯度。采用过碘酸钠法将抗体标记HRP，通过竞争ELISA法鉴定针对同一抗原不同表位的特异性单抗。

1.2.5CLIA的建立及性能分析

1.2.5.1CLIA的建立 将1株抗 PAPP-A mAb包被到ELISA板制成固相抗体，将另1株夹心的抗 PAPP-A mAb标记HRP制成酶标抗体。①以质控血清作为标准品稀释液，按比例将适量的PAPP-A加入到基质血清中，得到浓度分别为 0(S0)，100(S1)，1 000(S2)，2 500(S3)，5 000(S4)和10 000(S5)ng/ml的系列标准品。②在包被抗体板中20 μl 加入样品或标准品、100 μl酶标抗体，振荡混匀，37℃温育1 h。③洗板，加入适量鲁米诺，避光反应3 min后，测定各孔发光值(RLU)。④绘制PAPP-A浓度和对应RLU值的双对数标准曲线。

1.2.6ICG制备及性能分析

1.2.6.1抗体胶体金标记 ①在100 ml小烧杯中加入转子与胶体金，旋起转子，用0.1 mol/L K2CO3将胶体金pH调至8.0；②计算标记用的抗体取量，以10 μg/ml计算。将标记用的抗体用ddH2O稀释至300 μl。将稀释后的抗体缓慢加入到胶体金中。加入完成继续搅拌2 min后，室温避光静置15 min；③使用10% BSA溶液，以1%的终浓度进行封闭，缓慢加入10～15 min，继续旋转搅拌2 min后，室温避光静置15 min；④将封闭后的胶体金溶液置入1.5 ml离心管中，以3 500 r/min、4℃离心10 min，取上清，弃去沉淀；⑤将上一步离心的上清置于新的离心管，以12 000 r/min、4℃离心20 min，取沉淀，4℃储存备用。

1.2.6.2试纸条制备及分析 ① 溶液配制及制垫：标记后的沉淀(1 ml，未加BL液)用40 μl 金标储存液(BL液)复溶，再加入80 μl金标工作液B和13.2 μl ddH2O混匀(金标储存液+金标工作液B+ddH2O =10 μl+20 μl+3.3 μl)，胶体金最终用量为1.25%，金标垫为玻璃纤维，将玻璃纤维剪裁成宽0.5cm长条，截取所需长度，放于托盘上，将配制好的溶液均匀加到金标垫上30 μl/cm。②干燥:制好的胶金垫在37℃干燥2 h或者室温干燥8 h。③将NC膜贴于背板上;④划线: T线将包被抗体用PBS稀释到所需浓度，在T线的位置均匀划线C线羊抗鼠 IgG，PBS透析，每次划线之前取抗体与 0.2 mol/L NaCl等体积混合，使NaCl的终浓度为0.1 mol/L，加入1.5 μl 0.1 mol/L HCl调节pH值至5.5，混匀后，在C线的位置均匀划线，T线与C线间隔5 mm，每次实验保持一致：⑤贴在背板上的NC膜，在37℃干燥2 h或室温干燥8 h。⑥干燥后的金标垫、吸水纸以及样品垫贴到背板的指定位置，并适当压好，手工剪制金标试纸条。⑦测定试纸条的灵敏度及特异性灵敏度：用试纸条对PAPP-A(浓度为50、40、30、0 ng/ml)的血清样本进行灵敏度检测。特异性：用试纸条对PAPP-A(浓度为 100 ng/ml)、AFP(浓度为500 ng/ml)、PRL(浓度为20 ng/ml)、hPL(浓度为12 000 ng/ml)、HCG(浓度为2 000 U/ml)的血清样本进行检测。

2 结果

2.1杂交瘤细胞株的筛选 A/J小鼠尾部血清效价达到1∶10 000时可以进行细胞融合。融合后，筛选到5株阳性信号较强且分泌稳定的杂交瘤细胞株，细胞亚克隆后，将这5株杂交瘤细胞分别命名为#13-2-2、#20-1-1、#21-1-1、#44-1-1和#53-2-1。将其扩大培养后，收集细胞上清液，通过蛋白A纯化后，即可获得5株mAb。

2.2抗人PAPP-A mAb的鉴定

2.2.1抗体的纯度鉴定 在Mr25 kD、50 kD处各有1条清晰条带，正是轻链与重链的位置，其他位置无杂带，说明这5株抗人PAPP-A mAb的纯度均在95%以上。#44-1-1 mAb轻重链分子量均比其他4株小，这是由于小鼠IgG分为4个亚型，不同亚型分子量有差异，见图2。

2.2.2抗体的效价鉴定 mAb效价如下：#13-2-2为1.7×10-9g/ml，#20-1-1为3.3×10-9g/ml，#21-1-1为6.9×10-9g/ml，#44-1-1为4.0×10-9g/ml，#53-2-1为4.0×10-9g/ml，见图3。

2.2.3抗体的表位鉴定 将#20-1-1抗体进行HRP标记，使用竞争ELISA检测其余4株抗体与#20-1-1抗体是否竞争，来判别4株抗体是否与#20-1-1抗体抗PAPP-A抗原同一表位(图4)。抗体#13-2-2、#21-1-1、#44-1-1、#53-2-1与#20-1-1均不竞争，即抗不同的表位，可以进行双抗体夹心反应。

2.3双抗体夹心化学发光体系的建立 根据PAPP-A化学发光试剂盒行业标准规定的灵敏度不高于25 ng/ml，线性上限不低于2 500 ng/ml，相关系数r不低于0.990 0，选择抗体#13-2-2包被与抗体#20-1-1标记建立夹心体系，标准曲线，见图5。

2.4化学发光试剂盒的分析性能评估

2.4.1准确度 平均检测浓度为1 850.24 ng/ml，回收率R为107.2%。

2.4.3线性 将高值样本 10 000 ng /ml 按表1所示稀释为7个浓度，将这7个浓度与稀释比例用最小二乘法求得其线性相关系数r为0.996 6(表1)。

图2 SDS-PAGE检测抗人PAPP-A mAb纯度Fig.2 SDS-PAGE to detect anti-human PAPP-A mAb purityNote:Protein Mr marker；2.#13-2-2 mAb；3.#20-1-1 mAb；4.#21-1-1 mAb；5.#44-1-1 mAb；6.#53-2-1 mAb.

图3 间接ELISA法检测抗人PAPP-A mAb的效价Fig.3 Indirect ELISA to detect anti-human PAPP-A mAb titer

2.4.4重复性 浓度为500 ng/ml(低值)和3 500 ng/ml(高值)的样本其检测结果的CV值分别为5.46%、9.52%(表2)。

2.4.5特异性 用PAPP-A双抗体夹心试剂盒检测样本AFP、PRL、hPL和HCG，其检测值均小于10 ng/ml(图6)，因此认为该试剂盒与以上4种物质均不发生交叉反应。

2.5胶体金试纸条

2.5.1试纸条灵敏度 PAPP-A(浓度为50 ng/ml)阳性样本在试纸条的T线上出现清晰红色条带，所以此胶体金体系灵敏度不小于50 ng/ml，见图7。

图4 竞争ELISA法检测抗人PAPP-A mAb表位Fig.4 Competition ELISA assay of anti-human PAPP-A mAb epitope

图5 PAPP-A双抗体夹心标准曲线Fig.5 PAPP-A double-antibody sandwich standard curve

表1 线性评估试验结果

表2 试验结果重复性评估

图6 PAPP-A双抗体夹心特异性检测Fig.6 PAPP-A specific detection of double-antibody sandwich

图8 试纸条特异性Fig.8 Specificity of test stripNote:1.PAPP-A(100 ng/ml)；2.AFP(500 ng/ml)；3.PRL(20 ng/ml)；4.hPL(12 000 ng/ml)；5.HCG(2 000 ng/ml).

2.5.2试纸条特异性 PAPP-A阳性血清在试纸条的T线上出现清晰红色条带，而AFP、PRL、hPL及HCG阳性血清的T线上没有出现明显条带，说明未发生交叉反应，见图8。

3 讨论

PAPP-A由胎盘与蜕膜产生，在妊娠期间被大量释放到孕妇的外周血中，其在受精卵着床、胎儿的生长发育中均起重要作用。正常情况下，随着妊娠的发展，孕妇体内PAPP-A的水平不断升高，但在唐氏综合征胎儿孕妇体内，妊娠早期PAPP-A的水平要明显低于正常孕妇，至孕中期，PAPP-A水平与正常孕妇的差异无统计学意义，美国的DS诊断指南始终将孕早期PAPP-A偏低作为DS的诊断指标[21]。此外，血清PAPP-A 水平升高可以反映动脉粥样硬化斑块的不稳定性，可以作为预测大动脉粥样斑块稳定性的一种新的血清学指标[22]。最近研究发现，多种癌症中PAPP-A高表达，PAPP-A有望成为癌症治疗靶点或肿瘤标志物。因此PAPP-A含量的检测具有重要的临床应用价值。

目前，PAPP-A的检测方法主要是放射免疫法、ELISA法、时间分辨荧光免疫法及化学发光法。放射免疫法需要纯化的PAPP-A作为标准和示踪剂，但是纯化PAPP-A的过程非常复杂，且碘会产生放射性污染。ELISA疫法操作简单，但灵敏度及特异性不高，存在假阳性。时间分辨荧光免疫法具有高灵敏度和较宽的线性范围，但该方法中采用的是PAPP-A多克隆抗体，由于PAPP-A在血清中以复合物形式存在，因此存在交叉反应，降低了检测特异性。而化学发光法是一种以量度标记物化学反应所产生的光量为基础的分析方法，其灵敏度高、特异性强、低背景噪音、化学反应简单、快速、线性范围宽，被认为是最具有发展前景的实验室诊断方法之一[23]。由于进口产品价格昂贵，因此成功研制和生产PAPP-A定量测定化学发光试剂盒及胶体金试纸条具有重要的社会和经济效益。

本研究采用杂交瘤细胞高通量筛选策略，获得5株阳性信号较强、稳定分泌、高亲和力、高特异性抗体与高产量的PAPP-A杂交瘤细胞株[20]。杂交瘤细胞经过无血清培养基扩大培养，其上清采用protein A免疫亲和纯化，使所得单克隆抗体避免牛血清中免疫球蛋白的污染，纯度达到95%以上。5株单抗效价均在1×10-8g/ml以上，为后续化学发光试剂盒及胶体金试纸条的研制提供了高质量的原料，同时为提高试剂盒(条)的灵敏度奠定了基础。

本研究建立的双抗体夹心检测PAPP-A的化学发光体系灵敏度、重复性、准确性和特异性均能达行业标准。其中该体系在0～10 000 ng/ml的检测范围内呈现较好的线性关系(r≥0.990 0)；本研究所建立的化学发光检测体系与AFP、PRL、hPL和HCG等与PAPP-A相似的血清标志物进行特异性检测，结果表明，该体系与以上4种物质均不发生交叉反应，排除了血清中相关物质的干扰，增加PAPP-A定量的准确性。本研究开发的胶体金试纸条具有成本低、操作简单、灵敏度和特异性高、携带、储存和运输方便等优点。