淫羊藿苷通过调节Nrf2/HO-1信号通路减轻大鼠肾缺血再灌注损伤①

陈明霞 张 恩 刘 芳 张娟红 陆卫红 冷 伟

(陕西中医药大学，咸阳 712000)

肾缺血再灌注损伤(renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是指肾脏缺血一段时间后血液回流到组织而引起的组织损伤，导致细胞蛋白、脂质和DNA严重损伤，引起氧化应激、炎症，最终导致细胞凋亡和坏死。RIRI是术后急性肾功能不全的主要原因之一，对患者的预后不利，导致肾衰竭， 甚至危及生命。RIRI的病理生理过程复杂，目前尚无有效治疗方法。因此本研究将开发新的用于RIRI治疗的药物并研究其分子机制。

淫羊藿又名仙灵脾、刚前，是一种治疗骨质疏松症、心血管功能障碍、改善神经功能和性功能的中草药，为多年生草本植物[1]。《神农本草经》记载淫羊藿具有滋阴补阳、壮阳强身之效。淫羊藿苷(Icariin，ICA)为淫羊藿活性成分的提取物，具有强大的心血管保护功能，可抗动脉粥样硬化、改善血管内皮功能障碍[2-5]。研究发现，ICA对新生儿心肌细胞缺氧复氧损伤具有保护作用，但在RIRI中的作用研究鲜有报道[6]。因此，本研究借助RIRI大鼠模型，研究ICA对RIRI的保护作用，及其分子机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 SPF级SD大鼠40只，雌雄不限，取自我院动物中心，许可证号：SYXK(川)2018-213，体质量200～230 g。于(23±3)℃、湿度40%～70%条件下适应性饲养7 d，自由摄食饮水，昼夜节律12 h。

1.1.2试剂 ICA(110737-201516)购自中国食品药品检定研究院，含量94.2%；生理盐水(merck-millipore，02-0780-00)；水合氯醛(经科公司，JKLN006718)；染色液(古朵，GD-K4042)；PBS(Miltenyi，DXT-130-070-525)；ELISA试剂盒(westang，f00001)；MDA检测试剂盒[jingkang，JK-(a)-2197]；SOD检测试剂盒[jingkang，JK-(a)-2293]；TUNEL染色酶(Roche，11767305001)；蛋白酶K(源叶，S10085)；DAPI(源叶，S19119)；RIPA裂解液(源叶，R12135)；脱脂奶粉(源叶，S30865);抗体Cleaved Caspase-3(Asp175)Antibody #9661、Cleaved Caspase-9(Asp315)(D8I9E)Rabbit mAb #20750、NRF2(D1Z9C)XP® Rabbit mAb #12721、HO-1(E9H3A)Rabbit mAb(Mouse Specific)#86806、NQO1(A180)Mouse mAb #3187购自CST公司。

1.1.3仪器 生物安全柜(鑫贝西，11228 BBC86)；生物显微镜(意大利OPTIKA，B-510BF)；生化分析仪(科华卓越，LFF-LC-1817)；酶标仪(QIAGEN，9232933)；玻璃匀浆器-Glass Homogenizer(Ybscience，YB101103-1)；倒置荧光显微镜(mshot，MF52)；凝胶成像系统(AXYGEN，GDBL-1000)。1.2方法

1.2.1RIRI造模及分组 采用微型动脉夹夹闭双侧肾蒂法制备大鼠RIRI模型。术前禁水4 h，禁食12 h。采用2%异氟烷和氧气/氧化亚氮混合气体吸入法麻醉大鼠，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定，切开腹中线。用微型动脉夹夹闭双侧肾蒂，肾脏颜色变为暗红色提示诱导缺血成功，移去微型动脉夹，耗时约40～50 min。当肾脏颜色由红变白再变为鲜红色时，RIRI模型构建成功，缝合伤口。假手术组仅切开腹中线，不夹闭双侧肾蒂。术后将大鼠置于37℃苏醒，同等条件下正常饲养24 h 后处死，收集血清或肾组织用于后续试验，-80℃保存备用。RIRI模型大鼠随机分为4组：ICA组(60 mg/kg)、RIRI组、RIRI+ICA低剂量组(30 mg/kg)和RIRI+ICA高剂量组(60 mg/kg)，每组8只。ICA处理组在术前用相应剂量的ICA对大鼠进行连续3 d的灌胃预处理。假手术组给予等体积生理盐水。

1.2.2HE染色观察肾组织病理损伤 取待检RIRI组织，固定包埋，切4 μm厚片，各试验组制作5片，从中选取1片进行分析。根据HE染色液说明书进行染色。染色后在各切片中选取5个区域观察，随机选取1个区域作为试验结果。

1.2.3肾功能评估 提取RIRI后的待检血液样本，4℃、2 000 g离心15 min，取上清。生化分析仪检测血清中BUN和Cr表达水平。各试验组检测5组数据，除去最高值和最低值进行统计分析。

1.2.4ELISA 根据ELISA试剂盒说明书检测待检血清中炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)水平。将酶复合物用稀释液稀释，加血清及TNF-α、IL-1β和IL-6的阴性和阳性对照物，孵育1 h，洗板，加底物，避光反应30 min后加终止液完成反应。酶标仪检测450 nm处TNF-α、IL-1β和IL-6吸光度。

1.2.5氧化应激检测 待检血液样本于4℃、2 000 g 离心15 min，取上清。根据MDA和SOD检测试剂盒说明书检测试验组大鼠血清MDA和SOD水平。SOD水平上升、MDA水平下降则表示氧化应激减轻。

1.2.6TUNEL检测细胞凋亡情况 取待检RIRI组织，固定包埋，切4 μm厚片，各试验组制作5片，从中选取1片进行试验。二甲苯醇脱羧，蛋白酶K(20 μg/ml)37℃处理15 min。PBS洗涤3次，TUNEL染色酶37℃处理30 min。PBS洗涤3次，DAPI染色，倒置荧光显微镜分析各试验组肾组织细胞凋亡情况。

1.2.7Western blot检测Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Nrf2/p-Nrf2、HO-1和NQO1表达 RIPA裂解液溶解肾组织，提取蛋白，双辛酸法定量。各试验组取40 μg蛋白行SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉在室温下封膜2 h。加入Cleaved Caspase-3(1∶1 000)、Cleaved Caspase-9(1∶1 000)、Nrf2/p-Nrf2(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000)和NQO1(1∶1 000)一抗4℃孵育过夜。加入二抗室温孵育2 h。加入ECL观察条带，凝胶成像系统(AXYGEN)拍照。

2 结果

2.1ICA改善缺血再灌注后肾损伤 HE染色结果显示，ICA组与假手术组无明显病理损伤，表明60 mg/kg ICA对大鼠无明显毒副作用。RIRI组大鼠肾组织病理损伤明显，且随ICA剂量增加病理损伤减轻，表明ICA可剂量依赖性地缓解肾组织病理损伤和功能紊乱(图1A)。RIRI组大鼠BUN和Cr水平显著高于对照组和ICA组(P<0.01)，而RIRI+ICA低剂量组和RIRI+ICA高剂量组大鼠BUN和Cr水平比RIRI组显著降低，RIRI+ICA高剂量组降低更为显著(P<0.01，图1B)。提示大鼠肾缺血再灌注后，ICA剂量依赖性地降低血清BUN和Cr水平，改善缺血再灌注后大鼠肾损伤。

2.2ICA减轻RIRI引起的炎症反应和氧化应激 RIRI组炎症因子水平明显高于假手术组和ICA组(P<0.01)，RIRI+ICA低剂量组和RIRI+ICA高剂量组炎症因子水平降低，且RIRI+ICA高剂量组降低最为显著(P<0.01)。提示ICA剂量依赖性地降低大鼠RIRI后炎症因子表达。RIRI各组SOD水平相比于假手术组和ICA组明显下降(P<0.01)，RIRI+ICA低剂量组和高剂量组SOD水平相比于RIRI组明显上升，且呈剂量依赖性，其中RIRI+ICA高剂量组上升最为显著(P<0.01)。RIRI组MDA水平比假手术组和ICA组显著上升(P<0.01)，而RIRI+ICA低剂量组和高剂量组MDA水平相比RIRI组明显降低，且呈剂量依赖性，其中RIRI+ICA高剂量组降低最为明显(P<0.01)。说明ICA剂量依赖性地上调SOD，下调MDA，抑制氧化应激，缓解RIRI引起的炎症反应和氧化应激(图2)。

2.3ICA减轻RIRI引起的细胞凋亡 ICA组与假手术组细胞无显著凋亡现象，表明60 mg/kg ICA对大鼠无明显毒副作用，RIRI各组细胞凋亡显著，随ICA剂量上升细胞凋亡减少。RIRI组Cleaved Caspase-3 和 Cleaved Caspase-9 表达明显高于假手术组和ICA组(P<0.01)，且呈剂量依赖性(图3)。说明ICA通过抑制Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表达抑制细胞凋亡。

图1 ICA对缺血再灌注后肾损伤的影响

2.4ICA通过调节Nrf2/HO-1信号通路改善大鼠RIRI RIRI组p-Nrf2/Nrf2、HO-1和NQO1表达相比于假手术组和ICA组明显降低(P<0.01)，且呈剂量依赖性，表明ICA剂量依赖性地激活Nrf2/HO-1信号通路。加入通路抑制剂ML385(10 μmol/L)后，RIRI+ML385组p-Nrf2/Nrf2、HO-1和NQO1表达水平比RIRI组显著降低(P<0.05)，而RIRI+ICA+ML385组相比于RIRI+ML385组p-Nrf2/Nrf2、HO-1和NQO1表达明显上升(P<0.05)，表明ICA可逆转ML385对Nrf2/HO-1信号通路的抑制作用。RIRI+ML385组BUN和Cr含量明显高于RIRI组(P<0.05)，而RIRI+ICA+ML385组BUN和Cr含量明显低于RIRI+ML385组(P<0.05，图4)。说明ICA可剂量依赖性地逆转通路抑制剂ML385的作用，下调BUN和Cr水平。ICA以剂量依赖方式通过激活Nrf2/HO-1/NQO1信号通路减轻大鼠RIRI。

图2 ICA对RIRI引起的炎症和氧化应激的影响Fig.2 Effect of ICA on inflammation and oxidative stress caused by RIRINote:Compared with Sham，**.P<0.01;compared with RIRI，#.P<0.05,##.P<0.01.

图3 ICA减轻RIRI引起的细胞凋亡

图4 ICA通过调节Nrf2/HO-1信号通路改善大鼠RIRI损伤Fig.4 ICA improves rat RIRI injury by modulating Nrf2/HO-1 signaling pathwayNote:Compared with Sham,**.P<0.01;compared with RIRI，#.P<0.05,##.P<0.01.

3 讨论

RIRI是指肾缺血再灌注对肾组织造成的损伤，其原因并非缺血，而是恢复血液供应后，过量自由基攻击重新获得血液供应的组织内细胞。RIRI主要发生在创伤性休克、外科手术、器官移植、烧伤、冻伤和血栓等血液循环障碍性疾病之后，主要引发肾功能紊乱、炎症反应、氧化应激和细胞凋亡，导致损伤加重[7]。本研究利用生化分析仪检测RIRI后肾功能变化，结果显示BUN和Cr含量上升，说明缺血再灌注对肾脏造成了组织学损伤，以此标准评估肾功能。RIRI后BUN和Cr含量上升，说明缺血再灌注导致肾组织损伤和肾功能紊乱[8]。ELISA检测RIRI后炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)表达水平，结果显示，炎症因子表达水平上升，引起大鼠肾组织炎症反应，与既往研究结论相似[8]。SOD是氧化应激的重要酶，MDA是脂质过氧化的终产物。研究发现，RIRI后使用SOD清除自由基，对损伤组织具有一定保护作用[7]。本研究利用SOD和MDA检测试剂盒分别检测SOD和MDA表达水平，结果显示，RIRI后SOD表达水平降低，MDA表达水平上升，说明RIRI引发大鼠氧化应激。Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP被认为是不良组织反应的分子标志物和早期指标，提示细胞凋亡和炎症反应，导致蛋白改变[9，10]。本研究采用TUNEL染色检测RIRI后细胞凋亡情况，并进一步检测Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表达水平。结果发现，RIRI后细胞凋亡增加，Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表达升高，说明RIRI导致细胞凋亡，不良组织反应分子标志物表达上升。本研究中RIRI对肾的损害作用与既往研究结论相似[11，12]。研究发现，氧化苦参碱、阿立哌唑、四氢生物蝶呤、舒洛地特、罗布麻素等药物通过抑制炎症因子、氧化应激、细胞凋亡及激活抗凝血酶Ⅲ减弱RIRI[11-16]。本研究亦发现ICA可作为RIRI治疗的潜在药物。

ICA是从中草药淫羊藿中提取的黄酮类化合物，可减轻DNA损伤、抑制平滑肌细胞增殖和迁移、减少病灶面积和巨噬细胞浸润，防止血小板活化。ICA还能有效改善心血管系统功能，调整内分泌水平。临床上，ICA主要用于治疗绝经后骨质疏松症[17]。Zhang等[18]发现，ICA通过诱导Caspase依赖性凋亡抑制急性早期幼粒细胞白血病细胞生长。Jia等[19]研究表明，ICA通过抗氧化、抗炎症、抗凋亡特性在脊髓损伤中起神经保护作用。本研究探究了ICA对RIRI 的作用及分子机制。在大鼠RIRI后给予低剂量(30 mg/kg)和高剂量(60 mg/kg)ICA，结果发现，ICA剂量依赖性地下调血清BUN、Cr、炎症因子、MDA、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9水平，上调SOD水平，抑制细胞凋亡。说明ICA剂量依赖性地改善大鼠RIRI引起的肾损伤。

核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor-2，Nrf2)被认为是治疗癌症的靶分子，通过抑制Nrf2和诱导Nrf2 2种路径靶向治疗肿瘤[21]。Nezu等[22]研究发现，Nrf2在早期RIRI中高度活化可阻止肾小管损伤进展。本研究利用Western blot检测ICA对Nrf2表达的影响，并用通路抑制剂ML385(10 μmol/L)再次验证了Nrf2表达水平。结果显示，ICA剂量依赖性地上调RIRI后p-Nrf2/Nrf2、HO-1和NQO1表达，且可逆转通路抑制剂ML385对Nrf2通路的抑制作用，并使BUN和Cr含量降低，改善肾组织损伤和肾功能紊乱。结果表明，ICA剂量依赖性地调节Nrf2信号通路，减轻大鼠RIRI，与既往研究结果相似[22]。

醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO1)和血红素加氧酶(heme oxygenase 1，HO-1)属于抗氧化和抗凋亡基因[7]。NQO1是一种调节ROS生成的抗氧化蛋白，对RIRI诱导的肾损伤具有保护作用[23]。研究发现，RIRI后西地那非通过激活Nrf2、HO-1和NQO1对肾损伤起保护作用[24]。精氨酸通过Nrf2/HO-1信号通路减轻RIRI[25]。Nrf2/HO-1信号通路通过抑制糖原合酶Kinase-3β缓解糖尿病大鼠RIRI[26]。本研究利用Western blot检测给予ICA后HO-1和NQO-1表达水平的变化，并用通路抑制剂ML385再次验证了HO-1和NQO-1的表达及BUN、Cr含量。结果显示，ICA剂量依赖性地上调RIRI后HO-1和NQO1表达水平，且可逆转通路抑制剂ML385对HO-1和NQO1的抑制作用，下调BUN和Cr含量，调节HO-1和 NQO1信号通路，减轻大鼠肾损伤。

总之，ICA剂量依赖性地调节Nrf2/HO-1/ NQO1信号通路，改善RIRI引起的肾组织损伤和肾功能紊乱，减轻RIRI引起的炎症反应和氧化应激，并抑制细胞凋亡。