过表达miR-125a-5p靶向STAT3抑制结肠癌体外生长和治疗移植瘤裸鼠的研究①

高 蕾 曾俊涛 周真真 阚 娜 王小红

(三亚中心医院/海南省第三人民医院消化内科，三亚 572000)

结肠癌是常见的发生于直肠与乙状结肠交界处的消化道恶性肿瘤，根据2017年全国肿瘤登记处资料显示，我国结肠癌发病率居恶性肿瘤第3位，死亡率居恶性肿瘤第5位，且患者术后5 年生存率不足60%，急需新的治疗手段提高患者生存率[1，2]。miR-125家族根据其转录起始位点不同可分为miR-125a、miR-125b-1和miR-125b-2，其中miR-125a与卵巢癌、口腔癌、胰腺癌和头颈部鳞癌等发生发展相关[3-6]。研究表明，miR-125a-5p在结肠癌细胞中表达下调，过表达miR-125a-5p可抑制结肠癌细胞增殖并诱导其凋亡[7]。但miR-125a-5p对结肠癌的作用机制及其在体内的影响尚未明确。信号转导和转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)是一种重要的转录因子，在肿瘤的发生发展中起重要作用。研究表明STAT3能够促进结肠癌、胃癌和卵巢癌等肿瘤细胞增殖和转移，并干扰肿瘤细胞凋亡及机体的抗肿瘤免疫应答[8]。本文主要研究过表达miR-125a-5p抑制结肠癌的作用机制及其对移植结肠癌裸鼠的影响及机制，为结肠癌的诊断和治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1材料 人结肠癌SW480细胞购自上海通蔚生物科技有限公司；RPMI1640培养液、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；反转录试剂盒购自北京诺博莱德科技有限公司；Lipofectamine 2000 购自美国 Invitrogen 公司；单克隆抗体购自美国 Cell signal technology 公司；二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；裸鼠购自四川大学华西医院基因工程小鼠中心。

1.2方法

1.2.1靶基因预测 采用在线基因预测软件miRanda、TarBase、TargetScan预测miR-125a-5p的靶基因。荧光素酶报告基因实验进一步验证miR-125a-5p直接作用于STAT3。

1.2.2结肠癌SW480细胞培养及转染 结肠癌SW480细胞培养于含10% 胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的RMPI1640细胞培养体系中，5% CO2、37℃恒温培养。利用Lipofectamine 2000进行转染，miR-125a-5p mimic与pcDNA-STAT3单独或联合转染SW480细胞。

1.2.3荧光素酶报告基因实验 miR-125a-5p mimic、STAT3 wt和STAT3 mut分别或同时对细胞进行转染，以海肾荧光素酶的荧光值作为内参，按照Dual Luciferase报告基因试剂盒说明书进行。

1.2.4RT-PCR TRIzol试剂盒提取细胞或组织总RNA，按试剂盒说明书逆转录为cDNA，RT-PCR检测。反应条件为： 98℃ 预变性30 s；98℃ 变性10 s，56℃ 退火30 s，72℃延伸 10 s，共 40 个循环；4℃ 保存。miR-125a-5p F：5′-ACTACATCCCTGAGAC-CCTTTAAC-3′，R：5′-TATGGTTGTTCTCCTCTCTGT-GTC-3′。GAPDH作为内参，应用凝胶成像系统摄影，Quan tity One 软件进行扫描分析，计算采用2-ΔΔCt法。

1.2.5Western blot PBS洗涤沉淀细胞2次，加入RIPA裂解液，冰浴30 min后离心取上清至新的EP管。BCA试剂盒测定蛋白浓度。取蛋白样品30 μg在浓缩胶60 V恒定电压、分离胶100 V恒定电压下进行电泳分离，转至PVDF膜。室温下用含5% 脱脂奶粉的TBST摇床封闭30 min。将封闭好的 PVDF膜置于相应的一抗溶液中，室温孵育 2 h。加入 TBST 稀释的二抗溶液，室温孵育 1 h，ECL曝光。

1.2.6克隆形成实验 取对数生长期细胞，以200个/孔接种于完全培养基，5% CO2、37℃培养2周，Gimesa染色观察。

1.2.7Transwell检测 接种胶细胞悬液铺于小室上室(100 μl/室)，细胞终浓度为8×104个/室，下室加入750 μl 含血清培养基，培养48 h后取出，结晶紫染色，显微镜下随机选取5个视野拍照，收集试验数据并分析。

1.2.8体内实验 裸鼠右后肢腹侧皮下注射0.2 ml 1×107个/ml的结肠癌SW480细胞悬液，依据注射细胞不同，分为Control组和miR-125a-5p mimic组，每组16只，雌雄各半。术后继续在SPF条件下饲养，正常饮食，观察裸鼠皮下成瘤情况，30 d 后颈椎脱位法处死裸鼠，完整取出皮下移植瘤，电子天平称重。组织标本于离体30 min内保存，一半置于液氮中冻存，一半置于4%多聚甲醛溶液中固定，每组随机选取3只进行后续实验。

1.2.9免疫组化 经常规10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，脱蜡水化。过氧化物酶阻断内源性过氧化物酶活性，非免疫性动物血清阻断非特异性反应。分别加入鼠抗人Ki67和Vimentin单抗，4℃孵育过夜。滴加生物素标记的二抗，DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明。封片观察统计。

2 结果

2.1靶向关系预测 通过基因预测软件TargetScan、miRanda和TarBase筛选出STAT3作为miR-125a-5p靶基因，miR-125a-5p与STAT3在3′UTR区存在结合位点(图1A)。RT-PCR检测miR-125a-5p的表达结果表明，与Control组相比，miR-125a-5p mimic-NC组miR-125a-5p表达差异无统计学意义，miR-125a-5p mimic组miR-125a-5p表达显著升高(P<0.01,图1B)。Western blot检测STAT3表达结果表明，与Control组相比，miR-125a-5p mimic组miR-125a-5p表达显著降低，说明过表达miR-125a-5p可抑制STAT3表达；STAT3组STAT3表达显著升高，说明pcDNA-STAT3质粒有效；STAT3+mimic组STAT3表达与Control组差异无统计学意义，比miR-125a-5p mimic组显著升高，比STAT3组显著降低， 说明miR-125a-5p和 STAT3存在靶向关系，且miR-125a-5p可抑制STAT3表达(P<0.01,图1C)。荧光素酶报告基因实验结果表明，miR-125a-5p对野生型STAT3表达有明显下调作用，对突变型无明显作用(P<0.01,图1D)，提示miR-125a-5p直接靶向作用于STAT3。

图1 miR-125a-5p直接靶向作用于STAT3Fig.1 miR-125a-5p directly targets STAT3Note:A.Target genes of miR-125a-5p screened by TargetScan,miRanda and TarBase;B.Expression of miR-125a-5p detected by RT-PCR;C.Expression of STAT3 detected by Western blot;D.Targeting relationship was detected by luciferase activity.Compared with control,**.P<0.01;compared with single transfection group,##.P<0.01;compared with PC-DNA,△△.P<0.01.

2.2miR-125a-5p过表达抑制结肠癌SW480细胞生长 与Control组相比，miR-125a-5p mimic组克隆形成显著减少，STAT3组克隆形成显著增多，说明过表达miR-125a-5p 可降低SW480细胞克隆形成能力，STAT3可增强SW480细胞克隆形成能力；STAT3+mimic组克隆形成与Control组差异无统计学意义，比miR-125a-5p mimic组显著增多，比STAT3组显著减少，说明过表达miR-125a-5p通过抑制STAT3进而抑制SW480细胞克隆形成(P<0.01)。与Control组相比，miR-125a-5p mimic组Ki67表达显著下调，caspase-3表达显著上调，STAT3组Ki67表达显著上调，caspase-3表达显著下调，说明过表达miR-125a-5p可抑制SW480细胞增殖并诱导SW480细胞凋亡，STAT3促进SW480细胞增殖并抑制细胞SW480凋亡；STAT3+mimic组Ki67和caspase-3表达与Control组差异无统计学意义，比miR-125a-5p mimic组Ki67表达显著上调，caspase-3表达显著下调，比STAT3组Ki67表达显著下调，caspase-3表达显著上调，说明过表达miR-125a-5p通过抑制STAT3抑制SW480细胞增殖并诱导SW480细胞凋亡(P<0.01,图2)。

图2 过表达miR-125a-5p对结肠癌SW480细胞生长的影响(×100)

2.3miR-125a-5p过表达抑制结肠癌SW480细胞侵袭 与Control组相比，miR-125a-5p mimic组侵袭细胞数显著减少，STAT3组侵袭细胞数显著增多，说明过表达miR-125a-5p 可降低SW480细胞侵袭能力，STAT3可增强SW480细胞侵袭能力；STAT3+mimic组侵袭细胞数与Control组差异无统计学意义，比miR-125a-5p mimic组显著增多，比STAT3组显著降低，说明过表达miR-125a-5p通过抑制STAT3抑制SW480细胞侵袭(P<0.01,图3)。

2.4miR-125a-5p过表达抑制结肠癌SW480细胞上皮间质转化 与Control组相比，miR-125a-5p mimic组侵袭细胞排列紧密，STAT3组侵袭细胞排列疏松，说明过表达miR-125a-5p可抑制SW480细胞上皮间质转化，STAT3可促进SW480细胞上皮间质转化；STAT3+mimic组与Control组差异无统计学意义，比miR-125a-5p mimic组排列疏松，比STAT3组排列紧密，说明过表达miR-125a-5p通过抑制STAT3抑制SW480细胞上皮间质转化(P<0.01)。与Control组相比，miR-125a-5p mimic 组E-cadherin 表达显著上调， Vimentin 和N-cadherin表达显著下调，STAT3组E-cadherin表达显著下调，Vimentin和N-cadherin表达显著上调，说明过表达miR-125a-5p 可抑制SW480细胞上皮间质转化，STAT3促进SW480细胞上皮间质转化；STAT3+mimic组Vimentin、N-cadherin和E-cadherin表达与Control组差异无统计学意义，比miR-125a-5p mimic组E-cadherin表达显著下调，Vimentin和N-cadherin表达显著上调，比STAT3组E-cadherin表达显著上调，Vimentin和N-cadherin表达显著下调，说明过表达miR-125a-5p通过抑制STAT3抑制SW480细胞上皮间质转化(P<0.01，图4)。

图3 Transwell检测细胞侵袭情况(×400)

图4 miR-125a-5p过表达抑制结肠癌SW480细胞上皮间质转化(×100)Fig.4 miR-125a-5p overexpression inhibits epithelial-mesenchymal transition in colon cancer SW480 cell(×100)Note:Compared with control， **.P<0.01;compared with single transfection group,##.P<0.01.

2.5Western blot检测STAT3下游靶基因Bcl-2、c-Myc和cycD表达 与Control组相比，miR-125a-5p mimic组Bcl-2、c-Myc和 cycD表达显著下调，STAT3组Bcl-2、c-Myc和 cycD表达显著上调，说明过表达miR-125a-5p可抑制SW480细胞STAT3下游靶基因表达，STAT3促进SW480细胞STAT3下游靶基因表达；STAT3+mimic组Bcl-2、c-Myc和 cycD表达与Control组差异无统计学意义，比miR-125a-5p mimic组Bcl-2、c-Myc和cycD表达显著上调，比STAT3组Bcl-2、c-Myc和cycD表达显著下调，说明过表达miR-125a-5p通过抑制STAT3抑制SW480细胞STAT3下游靶基因表达(P<0.01,图5)。

2.6裸鼠体内实验 与Control组相比，miR-125a-5p mimic组肿瘤重量显著减轻，说明miR-125a-5p过表达可抑制结肠癌发生发展(P<0.01，图6A)，miR-125a-5p mimic组miR-125a-5p表达显著下调，说明miR-125a-5p过表达可抑制miR-125a-5p表达(P<0.01，图6B)。miR-125a-5p mimic组Bcl-2、c-Myc、 cycD和STAT3表达显著下调，说明过表达miR-125a-5p 可抑制SW480细胞STAT3下游靶基因表达(P<0.01，图6C)。miR-125a-5p mimic组Ki67和Vimentin阳性比率显著降低， 说明过表达miR-125a-5p可抑制SW480细胞增殖和上皮间质转化(P<0.01，图6D)。

图5 Western blot检测Bcl-2、c-Myc和cycD表达Fig.5 Bcl-2,c-Myc and cycD expressions by Western blotNote:Compared with control，**.P<0.01;compared with single transfection group,##.P<0.01.

图6 裸鼠体内实验结果

3 讨论

miR-125a-5p通过不同靶点对肿瘤细胞发挥作用。Waresijiang等[9]发现miR-125a-5p通过靶向MMP-11抑制骨肉瘤细胞迁移、侵袭和上皮间质转化；Hsieh等[10]研究发现miR-125a-5p靶向HDAC4抑制乳腺癌发生；Zheng等[11]发现上调miR-125a-5p以NEDD9为靶点可抑制肺腺癌细胞增殖，诱导肺腺癌细胞凋亡。本研究发现在结肠癌SW480细胞中，miR-125a-5p直接靶向作用于STAT3，且对STAT3表达具有抑制作用。

miR-125a-5p在肿瘤细胞生长过程中起重要作用。Jia等[5]发现miR-125a-5p在胰腺导管腺癌组织中表达丰富，下调miR-125a-5p表达可抑制胰腺癌细胞生长并促进早期胰腺癌细胞凋亡；Li[12]等发现miR-125a-5p通过下调ErbB3抑制肝癌细胞增殖并诱导肝癌细胞凋亡；Zhong等[13]发现miR-125a-5p通过下调STAT3抑制肺癌细胞增殖和侵袭，促进肺癌细胞凋亡。本文通过克隆形成实验和Western blot检测Ki67和caspase-3表达发现，过表达miR-125a-5p通过抑制STAT3表达抑制结肠癌SW480细胞增殖和诱导其凋亡。

肿瘤细胞的快速侵袭转移是癌症治疗的难点，miR-125a-5p与肿瘤细胞侵袭转移密切相关。Cao等[14]发现miR-125a-5p通过靶向BRMS1抑制胃癌细胞侵袭转移，Yang等[3]发现miR-125a通过抑制GALNT14表达调控卵巢癌增殖和侵袭，Sun等[15]研究发现miR-125a-5p作为一种新型的Gab2抑制剂可抑制胶质瘤细胞侵袭。本研究通过Transwell检测细胞侵袭情况可知，过表达miR-125a-5p通过抑制STAT3表达进而抑制结肠癌SW480细胞侵袭。

上皮间质转化是肿瘤细胞的特征，miR-125a-5p在肿瘤细胞的上皮间质转化过程中起重要作用。Waresijiang等[9]发现miR-125a-5p通过靶向MMP-11抑制骨肉瘤细胞迁移、侵袭和上皮间质转化。本研究通过倒置显微镜观察和Western blot检测E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表达可知，过表达miR-125a-5p通过抑制STAT3表达进而抑制结肠癌SW480细胞上皮间质转化。

miR-125a-5p通过各种信号通路作用于肿瘤细胞。其通过p53依赖通路诱导人肺癌细胞凋亡[16]；Zhang等[17]发现下调miR-125a-5p可上调TAZ-EGFR信号通路并促进视网膜母细胞瘤增殖；Liang等[18]发现下调miR-125a-5p通过靶向p38/JNK/ERK通路促进涎腺腺样囊性肿瘤发生发展。Tong等[7]研究发现过表达miR-125a-5p通过靶向调节BCL2、BCL2L12 和MCL1通路抑制结肠癌细胞增殖并诱导其凋亡。本研究发现过表达miR-125a-5p通过抑制STAT3抑制SW480细胞STAT3下游靶基因Bcl-2、c-Myc和 cycD表达，从而抑制结肠癌发生发展。

体外研究发现，在结肠癌细胞中，过表达miR-125a-5p可靶向抑制STAT3，从而抑制细胞增殖、侵袭和上皮间质转化，并诱导细胞凋亡和抑制STAT3下游靶基因Bcl-2、c-Myc和 cycD表达。机体内环境极其复杂，为更好地研究过表达miR-125a-5p对结肠癌的作用机制，课题组进行了裸鼠体内实验。Fu等[19]通过体内实验验证了miR-125a-5p在前列腺癌中通过NAIF1调控癌细胞增殖和迁移；Qin等[20]通过小鼠体内实验验证了miR-125a-5p通过靶向ABL2调控人宫颈癌细胞增殖和迁移。本文通过裸鼠体内实验验证了在机体内过表达miR-125a-5p可抑制SW480细胞增殖和上皮间质转化，并可抑制SW480细胞STAT3下游靶基因Bcl-2、c-Myc和cycD表达，从而抑制结肠癌发生发展。

综上所述，过表达miR-125a-5p直接靶向抑制STAT3表达，从而抑制结肠癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化，同时诱导结肠癌SW480细胞凋亡，并抑制STAT3下游靶基因Bcl-2,c-Myc和 cycD表达，从而抑制结肠癌发生发展，为结肠癌的诊断和治疗提供了新的依据。