全自动酶免分析仪和酶标板快速孵育器联合进行ELISA检测操作其时间流程优化的实用性探讨

韩小娟，赵 玥，田洪伦，何 军

（1.贵州省第二人民医院检验科，贵阳 550004；2.温州医科大学检验医学院生命科学学院，浙江温州 325035）

酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）具有简便、快速、成本低等优点而被临床广泛运用[1-3]。近年来，由于全自动酶免分析仪能减少人工成本及人为操作误差，使检测流程更加标准和规范，提高检测结果的精确性和可溯源性，因此在临床检验中受到广泛应用。但全自动酶免仪样本孵育时间长，影响临床样本检测效率。酶标板快速孵育器因能缩短孵育时间，提高工作效率，在临床检验中的应用越来越多，但快速孵育法仍需要人工加样，增加了人工参与造成的误差。本实验通过利用全自动酶免分析仪联合酶标板快速孵育器检测乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg），探讨优化ELISA 操作流程在临床检验中的实用性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2018年1月～2019年9月经化学发光法定量检测HBsAg 阳性高值（≥250 IU/ml）、中 值（101～250 IU/ml）、低 值（0.05～100 IU/ml）样本各50 例，HBsAg 阴性样本50 例。其中男性112 例，女性88 例，年龄4 ～93 岁，平均年龄46 岁。

1.2 仪器与试剂 四川迈克i3000 化学发光免疫分析仪，嘉兴科瑞迪全自动酶联免疫分析仪（HB-500E)，成都盖森酶标板快速孵育器（MKF-6)。迈克生物股份有限公司化学发光法乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒，北京万泰生物药业有限公司酶联免疫法乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 所有收集的血清样本均保存于-80℃低温冰箱中直至分析。取出待检样本置于室温至完全融化混匀，待测。

1.3.2 化学发光法定量检测HBsAg (C 法)： 按照迈克生物股份有限公司乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒说明书和仪器SOP 操作，并严格执行质控标准。

1.3.3 ELISA 定性检测HBsAg：试剂盒室温放置30min 后分别用四种实验方法检测，A 法：使用全自动酶免分析仪进行孵育检测；B1，B2，B3 法：均使用全自动酶免分析仪加样、加试剂、洗板、比色，孵育时转移到酶标板快速孵育器进行孵育，其中B1 法孵育时间为说明书规定时间的1/2，B2法孵育时间为说明书规定时间的1/3，B3 法孵育时间为说明书规定时间的1/4，具体孵育时间见表1，其他操作步骤严格遵守试剂盒说明书和仪器SOP 进行。

1.3.4 计算每份样本的S/CO 值：以S/CO 值≥1时判断为样本HBsAg 阳性，S/CO 值＜1 时判断为样本HBsAg 阴性。A，B1，B2，B3 法分别与化学发光法（C 法）进行差异比较，同时计算各方法的总样本符合率、敏感度和特异度。

表1 各方法实验孵育时间

1.3.5 精密度评价实验：选用试剂盒配套的HBsAg阴阳性对照及第三方弱阳性质控品，使用 ELISA(A，B1，B2，B3 法)方法进行检测，每个质控品连续重复测定20 次，计算变异系数（CV%）。

1.4 统计学分析 使用SPSS19.0 统计软件对实验结果进行统计学处理，多组间差异的比较采用卡方（χ2）检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各方法检测HBsAg 精密度结果 见表2。根据说明书要求，阴性对照结果吸光度值＜0.10、阳性对照结果吸光度值＞0.80 时实验结果有效，第三方弱阳性质控S/CO 值为2 ～5 有效。20 次质控实验中，阴性对照结果吸光度均值0.008，阳性对照结果吸光度均值3.68，第三方弱阳性质控S/CO均值为3.98，实验结果有效。A，B1，B2，B3 法批内重复性实验（精密度）判断标准为说明书要求的精密度变异系数（CV%）≤15%，均在要求以内。

表2 各方法对HBsAg 的精密度检测（CV%)

2.2 各方法检测HBsAg 定性结果 见表3。各方法与化学发光法（C 法）检测结果进行比较，只有全自动酶免仪联合酶标板快速孵育器孵育时间缩短1/2（B1 法）时的阴阳性检测结果与化学发光法完全一致，全自动酶免仪单独检测（A法）时阴性结果一致，阳性结果有2 例不一致。但所有结果差异均无统计学意义（χ2=0～0.323，均P＞0.05）。

2.3 各方法检测HBsAg 总样本符合率、敏感度、特异度情况 见表4 。

表3 各方法检测HBsAg 定性结果（n=200）

表4 各方法检测HBsAg 总样本符合率、敏感度、特异度情况(%)

3 讨论

基于ELISA 具有成本低、简便、灵敏等优点，因而ELISA 的临床检验项目在各级医院都得到广泛开展。近年来，同一ELISA 检测方法在不同检测系统间的阳性符合率也越来越得到人们关注[4]。在ELISA 实验中，孵育是检测中影响检测成败的最关键因素之一[5]，因此，在确保检测结果准确性的前提下，优化检测流程和缩短检测时间对临床检验实际工作有重要的参考意义。

本研究以化学发光法作为检测的金标准，本次实验收集所有样本的乙肝血清学模式均为HBsAg，HBeAg 和HBcAb 阳性或HBsAg，HBeAb 和HBcAb阳性。本次实验采用全自动酶免分析仪联合酶标板快速孵育器新流程。新流程在缩短1/2 时间的情况下，其检测HBsAg 项目的敏感度比单纯的全自动酶免分析仪敏感度更高。由此可见，新流程极大地缩短了检验项目的时长，减少了临床医生和患者的等待时间。当新流程将孵育时间缩短为原规定时间的1/3 和1/4 时，虽然和化学发光法检测结果比较差异无统计学意义，但敏感度相对较低，有阳性漏检的可能，所以不推荐将孵育时间缩短为原时间的1/3 和1/4。

本研究还发现，全自动酶免分析仪联合酶标板快速孵育器检测一些低滴度阳性标本中的敏感度高于全自动酶免分析仪，其原因可能为酶标板快速孵育器的升温原理不一样。酶标板快速孵育器的原理主要是通过发热模块产生空气循环加热，使用多个方向风扇旋转使孵育腔内形成流动气体，保证温度的均匀性，且孵育全过程中结合振荡，促进抗原抗体结合，能一定程度上增加试剂的灵敏度[6]。而全自动酶免仪孵育室只有微孔板金属载架加温，反应板孔受热不均匀，孵育室整体空间比较大，升温曲线较慢，温度不准确，以及反应板周围环境可达到预期温度而孔内温度不能达到预期温度[7-8]。因此，在孵育过程中其实有大量的时间是用于升温过程，而最佳孵育段的时间并没有那么长。由此，金属底板单面加热可能是ELISA 自动化仪器的缺陷[9]。

研究中，HBsAg 含量越低，快速孵育缩短的时间越短，ELISA 漏检率越高。本文结果与刘丽等[6]人的研究结果相比，缩短1/3 时间敏感度略有不同，可能与本文所选取的低值样本较多和仪器试剂的敏感度不同有关。且本实验除孵育环节不一致外，其它步骤均由同一仪器操作完成，减少了实验的系统误差和偶然误差，使结果更具可比性。

通过本研究证实，优化后的全自动酶免分析仪联合酶标板快速孵育器的方法检测HBsAg，将孵育时间缩短至规定时间的1/2，在确保结果准确性的同时，缩短了整个检验项目的检测时间，提高了工作效率，这对临床标本的检测具有重要的应用价值。