Aurora-B激酶的表达与非小细胞肺癌患者预后及耐药的相关性分析

席俊峰，彭彦才，马兴聪，郝光军

（1.榆林市第一医院a.胸心外科；b 肿瘤科；陕西榆林 719000；2.西安交通大学第二附属医院肿瘤病院 ,西安 710004）

在我国，肺癌作为发病率和死亡率均位居首位的恶性肿瘤，严重影响患者的生命健康[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常见的类型，约占肺癌的85%。NSCLC 患者的5年生存率仅为15%[2-4]。目前临床上NSCLC 治疗方法主要有化疗、放疗、手术、分子靶向治疗和免疫治疗，但是由于耐药性和以上方法导致的毒副反应时常影响临床疗效和患者的预后。

近年来有研究表明，Aurora-B 激酶对乳腺癌、结直肠癌、肝癌等恶性肿瘤化疗耐药性的产生具有重要调控作用[5-8]，但其在肺癌中的作用鲜有报道。本研究主要目的是通过对临床NSCLC组织的检测，探究Aurora-B 激酶在NSCLC 组织中的表达情况及其与患者预后的相关性，为发现NSCLC 新的分子治疗靶点提供理论依据，另外通过细胞培养方法分析Aurora-B 激酶的表达与肿瘤细胞耐药性的关系。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究选取2006年2月～2012年11月榆林市第一医院收治并术后经病理检查确诊为NSCLC 的194 例患者为研究对象，年龄37～72 岁，中位年龄56 岁。患者均在签署知情同意书后获取其临床样本、病案信息以及远期临床随访资料。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器 Aurora-B 抗体(美国LSBIO 公司)；紫杉醇(四川协力制药有限公司)；顺铂(德州德药制药有限公司)；DAB 显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；光学显微镜(日本Olymps 公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色检测：Aurora-B 激酶的表达:应用常规方法进行病理组织脱蜡和水化后，用3%(体积分数)的过氧化氢溶液在室温下处理组织样本10 min，然后用PBS 漂洗病理组织样本，将样本浸入枸橼酸钠溶液，水浴中加热至95℃～100℃20 min。PBS 漂洗3 次，5 min/次。加入10g/ml 山羊血清孵育30 min。最后加入稀释200×兔抗人Aurora-B 抗体，37℃孵育2 h。PBS漂洗后加入二抗37℃孵育15 min。再次PBS 漂洗后加入辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育15 min。自来水充分冲洗，复染，脱水，透明， 封片。

1.3.2 免疫组化结果判断标准：在光学显微镜下用高倍镜(×400)进行观察，随机选取每张切片中的5 个视野，并且每个视野计数200 个细胞。通过观察NSCLC 细胞核的染色情况评估Aurora-B 激酶表达。染色阳性的判断标准：NSCLC 细胞核内出现清晰黄色或棕黄色颗粒。每张切片均由两名具有10年以上病理科工作经验的执业医师在双盲条件下独立阅读，评估结果不一致时重新阅片并协商以确定结果。本次研究中两位读片人读片结果一致率为96.39%。

1.3.3 耐药性诱导实验：本研究主要针对NSCLC治疗中的两种常用药物，紫杉醇(Paclitaxel，PTX)和顺铂(Cisplatin，CDDP)进行耐药性诱导实验。随机选取60 例NSCLC 患者的肿瘤组织约1.0cm3大小尽量剔除纤维组织及黑色颗粒，立即浸入无菌培养瓶中，并于10 min 内转运至实验室。在超净台上，用无菌PBS 液冲洗2 次，无菌切除组织包膜，结缔组织与坏死组织，剪成尽可能小的组织碎块，大小约1mm3。将组织小块置于0.25g/dl 胰酶40ml中，装入培养瓶，置于37℃水浴箱中30 min，使其充分消化，期间在镜下观察，当细胞变圆接近脱壁时，弃消化液，用10 ml 完全-1640 终止消化。用200 目筛网将消化后的细胞悬液过滤收集，用无菌PBS 液洗涤2 次(离心，1 500 r/min)，悬于20ml 完全-1640 中，镜下观察细胞。于无菌离心管中依次轻轻加入100%及60%的淋巴细胞分离液各10ml，其上再沿管壁轻轻加入细胞悬液(离心，2 000 r/min，20min)，收集60%分离液界面上的细胞，加5 倍无菌PBS 液，2 000r/min 离心20 min，去上清，加15 ml 无菌PBS 液，离心前进行细胞计数，再次离心，2 000r/min，20min，去上清，调整细胞浓度为 1×105/ml～2×105/ml。后经免疫组化染色确认，其中Aurora-B 激酶表达阳性患者41 例，Aurora-B 激酶表达阴性患者19 例。

首先将1×104个肿瘤细胞置于96 孔板中吸附6 h，然后加入浓度梯度依次为0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μmol/L 的PTX 和CDDP，孵育72 h。MTT 实验法测定细胞增殖并计算IC50 值。耐药性诱导实验以IC50 值为诱导浓度，在细胞中加入浓度梯度(0～100μmol/L)的PTX 和CDDP 后孵育72 h，通过MTT 实验法确定耐药性引导后的IC50 值。

1.4 统计学分析 采用SPSS19.0 统计学软件进行数据分析。采用χ2检验分析分类资料组间差异，定量资料采用两独立样本t 检验比较组间差异。采用Log-Rank 检验比较患者生存时间的组间差异并绘制K-M 生存曲线。应用COX 模型分析影响患者预后的因素。本研究中I 类错误控制水平α 取值为0.05，P＜0.05 时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Aurora-B 激酶的表达与NSCLC 患者临床病理特征的相关性 见图1 A～D 。Aurora-B 激酶表达于NSCLC 细胞核中，阳性颗粒染色清晰、对比度强且阳性细胞核较大，见表1。Aurora-B 激酶的表达与NSCLC 患者的组织类型和临床分期显著相关，并且其差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图1 Aurora-B 蛋白在非小细胞肺癌组织中表达情况

表1 Aurora-B 激酶表达与患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.2 Aurora-B 激酶的表达与NSCLC 患者预后的关系 见图2。Log-Rank 检验结果提示Aurora-B 激酶阳性患者较Aurora-B 激酶阴性患者的总体生存率缩短，并且其差异具有统计学意义(P＜0.000 1)。

应用COX 回归模型对NSCLC 患者的生存时间进行单因素分析，结果见表2。Aurora-B激酶表达、病理组织类型和临床分期是NSCLC 患者生存时间的影响因素。多因素分析结果见表3。Aurora-B 激酶表达、病理组织类型和临床分期均可显著影响NSCLC 患者的生存时间。其差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。

图2 不同Aurora-B 激酶表达情况患者K-M 生存曲线

2.3 非小细胞肺癌患者Aurora-B 激酶与肿瘤细胞耐药的相关性 见图2。Aurora-B 激酶阳性的NSCLC 患者经CDDP 和PTX 耐药性诱导后IC50值显著升高，并且差异具有统计学意义(P＜0.000 1)。

3 讨论

Aurora 激酶家族都有相似的催化结构区域[9]，主要由较短的C 末端尾部及长度可以不断变化的N 末端防守侧翼。Aurora-B 激酶可于着丝粒内蛋白(inner centromere protein，INCENP) 和 存 活 素(survivin)共同组成染色体过客蛋白，并在中心体成熟、分裂、纺锤体组装和稳定等细胞生理过程中起重要作用。染色体过客蛋白在细胞分裂早期随染色体定位，在中期向内部着丝粒区域聚集，后期则离开染色体并移动至中心纺锤体。整个过程要求染色体过客蛋白的各组成部分有准确的定位，一旦任何组成成员缺失或者Aurora-B 激酶活性不足都能造成定位错误和整体结构不稳定[10]，最终导致细胞分离异常。

表2 NSCLC 患者生存时间的单因素分析

表3 NSCLC 患者生存时间的多因素分析

表4 NSCLC 患者Aurora-B 激酶表达与耐药的相关性

已有研究证实Aurora-A 激酶与人多种实体瘤的发生发展密切相关。而关于Aurora-B 激酶的研究较少。有研究显示，Aurora-B 激酶在胶质瘤细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞中存在高表达，并且肿瘤细胞染色体出现成倍增长[11-13]。本研究发现，在非小细胞肺癌细胞中Aurora-B 激酶存在过表达情况，并且Aurora-B 激酶异常表达与患者的预后显著相关。生存分析结果显示Aurora-B 激酶表达阳性是患者预后的重要影响因素。

本次研究还对Aurora-B 激酶与CDDP 和PTX耐药间的关系进行了研究。研究结果提示Aurora-B的过度表达与肿瘤细胞对CDDP 及PTX 的耐药存在相关关系，此研究结论与其他实体瘤化疗耐药性研究如卵巢浆液性癌，乳腺癌中所发现Aurora-B与化疗药物耐药性存在相关性的结论一致。在正常情况下，细胞分裂的过程会触发p53 的活化以及下游修复和凋亡通路，清除处于异常增殖状态的细胞。然而，在Aurora-B 过表达的情况下，p53 的大部分受到泛素介导的蛋白降解，这进一步降低了p21 和BAX 的表达[14]。BAX 是一种促凋亡因子，p21 是DNA 损伤的应答物，通过在G1/S 期阻滞细胞周期，激活细胞凋亡[15-16]。p21 和BAX 的缺失使DNA 损伤和染色体数目异常的细胞绕过增殖异常细胞检查及清除过程，避开损伤修复，最终影响针对癌细胞DNA 和细胞周期的药物疗效，导致耐药[16]。

综上，本研究结果表明，Aurora-B 激酶的过度表达与非小细胞肺癌的病理生理过程密切相关，Aurora-B 激酶可能参与了非小细胞肺癌的发生及恶性进展，与患者不良预后及耐药相关。以上结论提示Aurora-B 可能是非小细胞肺癌的新标志物及潜在治疗靶点。后续我们拟从RNA 水平验证上述结论，并利用细胞学、分子生物学及形态学等研究方法进一步探究Aurora-B 激酶对肿瘤生物学行为的影响及其作用机制。