血清外泌体miR-221和miR-378水平检测在胃癌诊断中的应用研究

张筱东，谢星星，李 佳，朱 帅

（1. 延安市人民医院检验科，陕西延安 716000；2. 延安大学医学院，陕西延安 716000）

胃癌(gastric cancer)在我国是发病率很高的一种恶性肿瘤，其死亡率根据近年统计占我国城乡人口癌症死因之第二位[1]。目前胃癌的早期诊断率比较低，多数患者在就诊时已经到了癌症中晚期或晚期。因此，寻找灵敏度和特异度比较高的胃癌肿瘤标志物，从而提高胃癌的早期诊断率非常有必要。微RNA 或microRNA（miRNA）是一类长度为21～23 个碱基的非编码小RNA 分子，他们的表达水平在多种癌症出现异常，并在不同肿瘤中呈差异表达，miRNA 目前被认为是可用于诊断恶性肿瘤的一种比较好的生物标志物。研究发现，胃癌患者的miRNA miR-221 和miR-378 表达水平均升高，对胃癌具有潜在诊断意义[2]。外泌体（exosome）是近年来发现的一种大小为30～150 nm 的微囊泡，由细胞分泌并在血液中循环，囊泡中携带着多种生物信息分子，如mRNA，miRNA，linRNA 和DNA片段等，这些信息分子往往与癌症发生、侵袭和转移相关，通过检测外泌体内容物中的特定信息分子对恶性肿瘤进行辅助诊断，在最近几年备受重视[3]。本文研究了血清外泌体中miR-221 和miR-378 的联合检测对诊断胃癌的应用价值，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017年1月～2020年1月在延安市人民医院就诊且经病理检查确诊的胃癌患者92 例为胃癌组，其中男性53 例，女性39 例，年龄46～81 岁。根据美国癌症联盟委员会第7 版胃癌肿瘤TNM 标准进行分期，其中I 期16 例，II 期21 例，III 期45 例，IV 期10 例。按分化程度分，分为低分化65 例，中、高分化27 例。纳入标准：患者经过胃镜检查和活检确诊为胃癌，患者同意并签署知情同意书。排除标准：并发有其他肿瘤，自身免疫性疾病/血液疾病，并发感染性疾病如肝炎、结核等，临床资料不完整。选择同期在我院诊断为胃息肉的患者68 例为胃息肉对照组，男性40 例，女性28 例，年龄46～81 岁。选择同期我院健康体检者50 例为健康对照组，男性29 例，女性21 例，年龄46～81 岁。以上三组的年龄和性别等一般资料匹配。

1.2 仪器与试剂 血清外泌体的提取采用日本SBI公司ExoQuick-TM 外泌体提取试剂，血清外泌体颗粒浓度用英国Malvern 公司Nanosight 试剂检测，Western Blot 检测用的兔抗calnexin，CD9，CD63和TSG101 蛋白一抗购自Abcam 上海贸易有限公司，羊抗兔二抗购自碧云天杭州生物科技有限公司，RNA 提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，miRNA 逆转录和定量测定分析用德国QIAGEN 公司的mirVana 试剂盒。

1.3 研究方法

1.3.1 血液标本采集：患者于确诊入院后2 周内进行采血，清晨空腹取静脉血10 ml，4℃静置30 min，1 800 r/min 离心20 min，弃上清，置-80℃冰箱保存。

1.3.2 外泌体提取鉴定：血清外泌体的提取严格按照SBI 公司ExoQuick-TM 外泌体提取试剂盒的说明进行操作。外泌体鉴定用Western Blot 检测外泌体表面4 种蛋白标志物（calnexin，CD9，CD63 和TSG101 蛋白）的表达水平。血清外泌体颗粒浓度检测用Nanosight 法，将样品稀释50 00～20 000 倍，使样品中颗粒浓度为107/ml～109/ml，Nanosight 检测参数不变、阈值设定为5。

1.3.3 外泌体miRNA 定量测定：外泌体中miRNA的定量测定，先用RNA 提取试剂提取外泌体总RNA，再用mirVana 试剂以实时荧光定量PCR（RTqPCR）对miRNA 进行逆转录和定量测定分析。按照miR-221 和miR-378 在GeneBank 中的序列号，用Premier Primer 5.0 软件进行引物序列设计。RTqPCR 的总反应体系为25 μl，预变性95℃ 10 min，反应条件95℃ 5s，60℃ 60s，反应40 个循环。用ABI7700 软件采集荧光信号做溶解曲线分析，每样品3个复孔，进行绝对定量测定分析。用化学合成的1 mol/L miRNA，稀释成不同浓度作为标准品（106, 105, 104, 103, 102fmol/L），以每个浓度的对数值为X 轴，以每个浓度相对应的Ct 值为Y 轴，绘制标准曲线。用标准曲线根据所测得的Ct 值计算miR-221 和miR-378 的绝对浓度。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22. 0 统计软件做统计学分析。实验结果计量资料用均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t 检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），在此之后用LSD 做两两比较分析，用ROC 曲线评估miR-221 和miR-378联合检验在胃癌诊断中的效能，率的比较用卡方检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体鉴定 血清外泌体标本经Western Blot分析鉴定，结果显示，来自胃癌组、胃息肉组和健康组的血清外泌体标本的Calnexin，CD63，CD93和TSG101 这4 种外泌体标志蛋白均呈高表达，而来自相应组细胞裂解物的这4 种标志性蛋白均呈低表达。Nanosight 颗粒浓度检测结果显示，标本中含有大量的直径为30～100 nm 的细胞外微囊泡颗粒。故认为所获得的血清外泌体标本中确实含有外泌体。

2.2 外泌体miR-221 和miR-378 定量检测 见表1。血清外泌体标本中miR-221 和miR-378 水平用RTqPCR 进行定量检测，检测结果经ANOVA 分析发现各组均数之间的差异均有统计学意义（均P＜0.01）。进一步用LSD 做两两比较分析，结果显示，血清外泌体miR-221 和miR-378 水平在胃癌组和健康对照组(F=10.986，10.721)之间、在胃癌组和胃息肉组(F=7.112，7.238)之间以及在胃息肉组和健康对照组(F=3.863,3.579)之间差异均有显著性统计学意义(均P ＜0.01)，胃癌组高于健康对照组并高于胃息肉组、胃息肉组高于健康对照组，差异均有统计学意义（均P ＜0.01）。

表1 三组间血清外泌体miR-221 和miR-378水平（±s）比较

检测项目(fmol/L)胃癌组（n=92）胃息肉组（n=68）健康组（n=50） P miR-221 197.62±27.88 114.70±20.54 54.49±13.75 ＜0.01 miR-378 189.44±25.36 101.39±17.28 47.65±13.09 ＜0.01

2.3 外泌体miR-221 与miR-378 联合检测的诊断效能评价 见表2 和表3。用ROC 曲线分析比较外泌体miR-221 与miR-378 单独检测和联合检测对胃癌组和健康对照组诊断效能的数据显示，miR-221的曲线下面积为0.689，miR-378 的曲线下面积为0.657，联合检测miR-221 和miR-378 的曲线下面积为0.776，联合检测的特异度、灵敏度、诊断符合率以及阴性预测值均明显高于单独检测，差异具有统计学意义（均P ＜0.05）。用ROC 曲线下面积分析比较miR-221 与miR-378 单独检测和联合检测对胃癌组和胃息肉组诊断效能的数据显示，miR-221 的曲线下面积为0.681，miR-378 的曲线下面积为0.672，联合检测miR-221 和miR-378 的曲线下面积为0.755，联合检测的特异度、灵敏度、诊断符合率以及阴性预测值都明显高于单独检测，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。以上结果说明，外泌体miR-221 与miR-378 联合检测对胃癌的诊断价值高于单独检测。

表3 外泌体miR-221 与miR-378 单独检测和联合检测对胃癌组和胃息肉组诊断效能的ROC 曲线分析

3 讨论

外泌体是细胞形成和分泌的一种具有脂质双层的膜性微囊泡，囊泡中包含有多种类型的小分子RNA，DNA 片段和蛋白质等生物信息分子。外泌体的直径介于30～100 nm，密度为1.11～1.19 g/ml[3]。几乎所有类型的细胞在正常和病理情况下均能形成和分泌外泌体，其形成过程包括细胞内内体颗粒的膜内陷形成多囊泡体，多囊泡体外膜与细胞膜融合后其中的囊泡被释放到胞外即为外泌体。外泌体广泛存在于血液循环、唾液、尿液、羊水和母乳中，在细胞间交流或信息传递、细胞增殖分化和免疫调节等多种过程中发挥重要的作用，并参与了心血管、消化、神经、免疫等疾病和肿瘤发生发展的过程，检测外泌体及其成分有望成为一种新的疾病诊断方法或辅助诊断方法[4]。

为保证外泌体和其他细胞外微囊泡研究的可信度与重复性，国际细胞外囊泡协会制定了最低要求的国际研究指南。外泌体的鉴定主要包括形态学特征、浓度和/或直径大小、表面蛋白分子鉴定等[5-6]。我们的研究中，外泌体鉴定用Western Blot 检测了外泌体表面4 种蛋白标志物（calnexin，CD9，CD63 和TSG101 蛋白）的表达水平，用Nanosight 法检测了外泌体的颗粒浓度，所用的方法和指标数均符合国际细胞外囊泡协会的要求。

基于外泌体检测的临床诊断大多聚焦于外泌体内容物的检测。外泌体核酸内容物的检测研究，多采用二代测序技术、杂交芯片技术和实时荧光定量PCR（RTqPCR）或液滴数字PCR 技术[5-6]。我们的研究，用RTqPCR 技术定量检测了来自胃癌患者、胃息肉患者和健康体检者的血清外泌体标本中的两种microRNA，miR-221 和miR-378 的水平。

MicroRNA 是一类由细胞基因组编码的长度约为22bp 的非编码单链小RNA 分子，广泛存在于各种真核生物，参与转录后水平的基因表达调控。迄今，已经报道了约3 万种miRNA 分子在不同动植物中存在，在人类中，已发现的约有2 600 种。在病理方面，miRNA 可以参与调控癌基因和抑癌基因的表达，因而在肿瘤发生发展中起着重要作用。miRNA 在多种肿瘤患者的血清/血浆和组织液中以非常稳定的形式存在，被认为是一种新的实用的肿瘤生物标志物，在多种肿瘤包括胃癌的诊断方面有很好的应用前景。

在我国已有不少关于胃癌miRNA 研究的报道[7-9]。LIU 等[10]用全基因组miRNA 微阵列技术研究发现，胃癌患者血浆中miR-378，miR-371-5p 和miR-187 表达水平升高，其中miR-378 在胃癌早期即表达升高。SONG 等[11]的研究发现，胃癌患者血浆miR-221，miR-744 以及miR-376c 的表达水平升高。ZHANG 等[12]的研究发现，miR-214 的表达在胃癌组织和患者血浆中均显著升高，其血浆水平在患者术后从第14 天至第30 天呈进行性下降。LI等[13]发现，miR-17-92 在胃癌患者中的表达上调。因此，以上miRNA 均可作为胃癌辅助性诊断的生物标志，联合检测则更有意义[14-16]。我们选择了miR-221 和miR-378，研究了血清外泌体中这两种miRNA 联合检测用于诊断胃癌的价值，结果显示，血清外泌体miR-221 和miR-378 水平联合检测对诊断胃癌有一定的应用价值。