LncRNATUG1在甲状腺癌组织中的表达及其对细胞增殖和迁移的影响

赵芳芳，郭 红，陈 嘉（汉中市人民医院内分泌科，陕西汉中 723000）

甲状腺癌（thyroid carcinoma，TC）是来源于甲状腺上皮细胞的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1%，其发病呈年轻化趋势，女性多发于男性[1]。临床上对TC 患者的治疗有肿瘤切除、药物靶向治疗、化疗放疗等手段，但治疗过程中仍然存在预后差等问题[2]，对患者的健康和生活质量产生严重影响。因此，进一步了解和揭示TC 的发生发展机制，找寻更多特异性分子标志物及治疗靶点，对临床诊治意义重大。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一段长度大于200 个核苷酸的RNA 序列，已被证实是癌症发生发展的关键调节因子[3-4]。牛磺酸上调基因1（taurine upregulated gene 1，TUG1） 是位于染色体22q12的一种LncRNA[5]，据报道LncRNA TUG1 已在多种癌症中表达上调，与癌症发生发展、细胞耐药及预后密切相关，如LncRNA TUG1 通过EZH2 调控LIMK2b 参与小细胞肺癌的细胞生长和化疗耐药性[6]；Meta 分析显示，lncRNA TUG1 升高是肿瘤患者不良总生存期（overall survival，OS）的独立预后标志物[7]；lncRNA TUG1 通过WNT/ catenin 通路促进上皮性卵巢癌细胞增殖和侵袭[8]。然而LncRNA TUG1 在TC 中的功能机制目前仍不清楚，因此，本研究探究了LncRNA TUG1 在TC 组织及细胞中的表达及其对细胞增殖、迁移、侵袭的作用，并初步探索其调控TC 发生发展的作用机制，为TC 的分子靶向治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2015年1月～2018年6月于我院进行肿瘤切除手术治疗并经病例确诊的36 例TC 组织标本（未分化癌5 例，滤泡状癌25 例，乳头状癌6 例）及其相对应正常的癌旁甲状腺组织。从ATCC 公司购买人TC 细胞株SW1736 和FTC-133 以及人正常甲状腺上皮细胞Nthy-ori 3-1，含10ml/dl 胎牛血清的Dulbecco 改良Eagle 培养基（DMEM）中培养。

1.2 试剂和仪器 酶联免疫检测仪购自美国 BioTek公司。PCR 扩增仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。Lipofectamine 2000 试剂盒及Trizol 试剂购自美国Invitrogen 公司。PrimeScript RT Reagent Kit 试剂盒及SYBR Prime Script RT-PCR Kit 试剂盒购自日本Takara 公司。DMEM 培养基购自美国 HyClone公司。6 孔板、96 孔板及Transwell 小室购自美国Corning 公司。E-cadherin 抗体、N-cadherin 抗体和GAPDH 抗体购自美国Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 实时定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）：用Trizol 试剂提取组织和细胞的总RNA。使用PrimeScript RT Reagent Kit 根据说明书进行逆 转 录。 使 用SYBR Prime Script RT-PCR Kit 进行qRT-PCR。引物如下，LncRNA TUG1 正向：5’-CTATACTCAGCTTCAGTGTT-3’，反向：5’-TA CTGTATGGCCACCACTCC-3’；GAPDH 正向：5’-GAAGGCTGGGGCTCATTTGCAGGG-3’， 反 向：5’-GGTGCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’。对纯 化的RNA 进行qRT-PCR 分析，并用GAPDH 内参进行校正。

1.3.2 LncRNA TUG1 低表达细胞系模型构建：将shRNA 插入慢病毒质粒中构建LncRNA TUG1 低表达质粒（LV-shTUG1），以插入无意义序列的慢病毒载体（negative control）作为对照。使用LipofectamineTM2000 试剂盒（Invitrogen）按照说明书步骤将低表达质粒及对照质粒转染至细胞SW1736和FTC133 中。

1.3.3 MTT 实验和集落形成实验检测细胞增殖：MTT 法：将细胞接种于96 孔板培养24 h，利用pcDNA3.1 转染细胞，转染后0，24，48，72 和96 h，向每孔加入20 μl MTT 溶液，室温孵育4 h，除去培养基，每孔加入100 μl DMSO，于560 nm处测量吸光度（A）。集落形成实验：将细胞以500 个/孔浓度接种于6 孔板，在含10 ml/dl 胎牛血清的DMEM 中37 ℃温育两周，后固定细胞，0.1 g/dl 结晶紫染色，计数可见菌落数。

1.3.4 Transwell 试验检测细胞迁移：将含有5×104个细胞的细胞悬液置于Transwell 小室的上室，含10 ml/dl 胎牛血清的培养基加入Transwell 小室的下室，温育48 h，擦去残留在上膜中的细胞，用甲醇固定迁移过膜的细胞，下层细胞用0.1 g/dl 结晶紫染色并在显微镜下计数。

1.3.5 Western blot 检测EMT 相关蛋白表达：取转染后细胞，使用RIPA 裂解缓冲液提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，将提取蛋白与上样缓冲液混合，于10 g/dl SDS-PAGE 电泳，转移至PVDF 膜，5 g/dl BSA 室温封闭2 h，加入E-cadherin（1∶2000），N-cadherin（1∶2 000）一抗，室温孵育4 h，TBST洗膜3 次；加入二抗，室温孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每次15 min，使用增强的化学发光检测试剂盒检测信号，使用Tanon 5200 化学发光成像系统进行分析。

1.4 统计学分析 使用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，LncRNA TUG1 在甲状腺癌组织及癌旁组织中的表达差异应用配对样本t 检验；各细胞组间差异比较采用独立样本t 检验进行分析，P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA TUG1 在TC 组织及细胞中高表达 见图1。采用qRT-PCR 法检测显示，与癌旁正常组织相比，癌组织中LncRNA TUG1 表达（1.51±1.02 vs 6.90±1.19）显著升高，差异有统计学意义（t=20.634，P ＜0.000）；与正常甲状腺上皮Nthy-ori 3-1 细胞相比，FTC-133 细胞（1.00±0.09 vs 4.61±0.15）和SW1736 细胞（1.00±0.09 vs 2.59±0.23）中LncRNA TUG1 水平明显升高，差异有统计学意义（t=35.744，P ＜0.000；t=11.150，P ＜0.000）。

图1 qRT-PCR 法检测TC 组织及细胞中LncRNA TUG1 的表达水平（**P＜0.01）

2.2 敲降 LncRNA TUG1 表达抑制TC 细胞的增殖 见图2，图3。MTT 和集落形成实验检测显示，与对照组相比，敲降LncRNA TUG1 表达后SW1736 细胞（1.31±0.19 vs 0.89±0.16）和FTC-133 细胞（2.17±0.09 vs 1.68±0.05）增殖能力明显降低，克隆形成数目明显减少，差异有统计学意义（t=2.929，P=0.021；t=8.243，P=0.001）。

图3 集落形成实验检测敲降LncRNA TUG1 表达对TC 细胞克隆形成能力的影响

2.3 敲降 LncRNA TUG1 表达抑制TC 细胞的迁移 见图4。以FTC-133 细胞为例，Transwell 实验检测显示，与对照组相比，敲降LncRNA TUG1表达后，FTC-133 细胞迁移能力（1 675.2±64.2 vs 898.1±156.4）显著降低，差异有统计学意义 （t=7.961，P=0.001）。

图4 敲降LncRNA TUG1 表达对FTC-133 细胞迁移的影响（*P＜0.05）

2.4 敲降LncRNA TUG1 表达抑制TC 细胞EMT 的形成 见图5。采用Western blot 检测EMT 相关蛋白E-cadherin 和N-cadherin 的表达情况，结果显示：与对照组相比，敲降 LncRNA TUG1 表达后E-cadherin 表达量（0.74±0.06 vs 1.66±0.17）显著升高，N-cadherin 表达量（1.27±0.18 vs 0.39±0. 07）显著降低，差异有统计学意义（t=8.839，P ＜0.000；t=7.892，P=0.001）。提示LncRNA TUG1 促进TC细胞EMT 形成。

图5 LncRNA TUG1 调节EMT 相关蛋白的表达（**P＜0.01）

3 讨论

TC 是由机体碘缺乏、辐射、遗传等因素引起的最常见的恶性肿瘤之一，近年发病率呈逐年上升趋势[1]，但其具体的发病机制目前尚不清楚。LncRNA 通过多种途径调控基因表达及相关信号通路，进而调控肿瘤细胞的生物学行为，参与癌症的发生发展，被认为是多种癌症的关键调节因子[9]。深入研究LncRNA 与TC 发生发展间的关系，可以为TC 的分子诊断、靶向治疗及预测预后提供一定借鉴。

LncRNA 在表观遗传、转录和转录后水平上参与基因表达的调控[10]，被广泛报道通过多种机制调节病理生理过程，如基因印记，组蛋白修饰，染色质重塑，转录激活[11]等。并发现LncRNA 可通过与微小RNA（miRNA）竞争性结合并因此抑制其功能（即阻断与靶mRNA 的相互作用）[11]。大量研究发现，LncRNAs 在众多不同疾病类型中均差异表达，通过多种途径参与调控肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移等恶性生物学行为，诱导癌症的恶性进展，表现为原癌基因或抑癌基因发挥作用[12-16]。LncRNA TUG1 最初被鉴定为是由牛磺酸上调的转录物，在许多癌症中已经报道了LncRNA TUG1 的异常表达，发现TUG1 可通过招募某些RNA 结合蛋白，进而促进靶基因表达，影响肿瘤血管生成或充当竞争性内源性RNA（ceRNA）调控肿瘤的发生发展[5]。CAO 等[17]研究发现，LncRNA TUG1 是骨肉瘤患者存活的预后因素。LncRNA TUG1 高表达与膀胱癌和食管鳞癌细胞的增殖和转移有关[18-19]。NIU 等[6]研究发现，LncRNA TUG1 通 过EZH2调控LIMK2b 参与小细胞肺癌的细胞生长和化疗耐药性。LI 等[20]发现， LncRNA TUG1 通过与PRC2结合调节胃癌细胞增殖。WANG 等[21]研究发现，LncRNA TUG1 通过EMT 途径促进结肠直肠癌的转移。由此可见，LncRNA TUG1 在调节多种转录因子和生理过程中具有重要意义，提示TUG1 有望成为众多肿瘤诊断及预后的生物标志物或治疗新靶点。因此，研究LncRNA TUG1 在TC 中发挥的功能及其分子机制对寻找新的治疗靶点至关重要。

本研究应用qRT-PCR 检测发现TC 组织及细胞中LncRNA TUG1 表达水平较癌旁正常组织及正常甲状腺上皮细胞明显升高（P＜0.05），提示LncRNA TUG1 与TC 的发生发展密切相关。将shRNA 插入慢病毒质粒构建LncRNA TUG1 低表达细胞系，采用MTT 法、集落形成实验、Transwell实验于细胞水平检测发现敲降LncRNA TUG1 表达明显抑制TC 细胞的增殖及迁移能力（P＜0.05），提示TC 中LncRNA TUG1 扮演促癌基因。EMT 是上皮细胞获得迁移能力的有效方式，也是TC 细胞浸润转移的重要形式，因此本研究通过蛋白印迹探究了LncRNA TUG1 表达对TC 细胞EMT 形成的影响，发现敲降LncRNA TUG1 表达抑制了EMT 形成。表明LncRNA TUG1 在TC 中高表达，促进细胞的增殖及迁移，可能通过促进EMT 的形成进而发挥作用。本研究初步证明了LncRNA TUG1 通过调控EMT 形成参与TC 的发生发展，然而肿瘤的形成是一个复杂的调控过程，TUG1 调控肿瘤发生发展的方式多样，必定涉及多种基因或因子的相互调节及信号转导通路，其调控TC 恶性发展进程的分子机制还需进一步深入探究分析阐明。此外，包含TUG1 在内的多个LncRNA 近年被研究报道能够调控肿瘤能量代谢影响肿瘤恶性行为，其中LIN 等[22]在Hepatoligy 上报道TUG1 可调控肝癌细胞的糖酵解能力，影响癌细胞增殖、迁移。HAN 等[23]研究指出， LncRNA TUG1 通过调节糖酵解作用影响骨肉瘤细胞的存活率。徐苏娟等[24]通过Seahorse能量分析仪对卵巢癌OVCAR3 细胞糖酵解压力及线粒体压力变化，显示干扰TUG1 表达能显著降低癌细胞的线粒体呼吸和糖酵解通量，指出卵巢癌细胞的增殖及迁移可能与TUG1 调控肿瘤能量代谢有关。目前，糖酵解作为肿瘤能量来源已被广泛接受，且主流观点认为肿瘤细胞即使在足氧条件下，仍可通过糖酵解方式消耗大量葡萄糖以给肿瘤细胞供能，即瓦氏效应（Warburg effect）[25-26]。而TC 中LncRNA TUG1 是否也可通过调控能量代谢进而影响TC 的生物学行为本研究尚未触及，是本研究的不足和缺陷，但可将其作为后期研究的一个新的探究方向。

综上所述，LncRNA TUG1 在TC 中过表达，可能通过促进EMT 的形成进而促进癌细胞的增殖及迁移，可作为一种新的潜在癌基因，靶向抑制LncRNA TUG1 的表达可能是TC 治疗的一种新方法，对临床诊治及预测预后具有重要潜在价值。