山竹果皮提取物“芒果醚”抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖与迁移

黄凯悦， 刘敏燕， 陈 婷， 陆昌瑞， 赵 越， 邵志宇， 张云龙

(东华大学 化学化工与生物工程学院， 上海 201620)

据统计，全世界每年约170万新发乳腺癌病例，但其预防环境进展缓慢[1-2]。目前，癌症临床疗法包括化疗、放疗、手术、免疫治疗和其他方法[3]，个性化治疗也在不断推进，以减小副作用，提高总体生存率[4]。在乳腺癌治疗中非手术疗法也很重要，非手术抗癌方法主要有化疗和放疗，都会诱发氧化应激来杀死癌细胞。虽然放/化疗会对正常细胞造成伤害[5]，但仍是癌症治疗的标准方法[6-7]。近年来，科学界和制药行业在乳腺癌研究方面取得了显著进展，几乎所有类型乳腺癌治疗都已进入靶向治疗阶段[8]，化学合成药物通常是癌症化疗的唯一选择[9-10]，因而有效抑制肿瘤生长且低毒的靶向治疗药物是患者迫切需要的[11]。抗肿瘤药物按来源可分为化学合成药物(如烷化剂、抗代谢药等)或天然药物(如紫杉醇、喜树碱等)[12-13]。天然抗瘤药物开发最受关注，因其来源丰富，高效、低毒且副作用小[12]。

莽吉柿(Garciniamangostana)即山竹，主要分布于东南亚，属于藤黄科[13]。 其果皮含有大量的粗纤维，果胶和多酚。研究表明，山竹果皮提取物具有抗癌作用[14]，以及抗病毒和抗氧化[15-16]作用。在东南亚，这种提取物被用作治疗多种疾病的药物，现已有数百年的历史[17]。另外，山竹果皮提取物中存在芒果醚及4种已知氧杂蒽酮(2-5)[13]，并且芒果醚最早被泰国科学家在雷公藤植物中发现并证实其对4类肿瘤细胞存在毒性：MCF-7(人乳腺癌)，KB(人口腔癌)，HeLa(人宫颈癌)和HT-29(人结肠癌)。芒果醚全称为3,4-dihydro-5,9-dihydroxy-8-methoxy-7-(3-methoxy-3-methylbutyl)-2,2-dimethyl-2H,6H-pyrano-[3,2-b]xanthen-6-one，分子式为C25H30O7，是一种淡黄色针状晶体，其结构式见图1[13]。

图1 芒果醚结构式

本课题组从山竹果皮内提纯了一种芒果醚，并以吉西他滨(Gemcitabine，简称Gem)作为阳性对照24 h给药处理乳腺癌细胞，进一步检测其具有促发生细胞凋亡和降低细胞迁移的作用，并探析其分子机制，以期对乳腺癌治疗药物开发提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

芒果醚由本课题组提纯获取，吉西他滨由邵志宇课题组提供。MCF-7、MCF-10、MDA-MB-231和SUM1315MO2细胞均购于中科院细胞库(上海)；1×DMEM培养基购于Cellmax公司、胰酶酚红-EDTA消化液、100×双抗(青霉素&链霉素混合溶液)及胎牛血清均购于Gibco公司；细胞培养板购于Costar公司；二甲基亚砜(DMSO)购于MESGEN公司；CCK-8试剂盒和DPBS缓冲液购于上海碧云天公司；Hoechst 33342染液购于上海翊圣生物科技有限公司；TEMED、预染Marker、脱脂奶粉、Tris base、甘氨酸、Tween 20、氯化钠和丙烯酰胺均购于生工生物工程(上海)股份有限公司；SDS购于国药集团化学试剂有限公司；无水甲醇、无水乙醇均购于上海云丽经贸有限公司；二抗(羊抗兔)、Actin购于北京聚合美生物科技公司；一抗(Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Precaspase-9)购于CST公司；BSA购于BIOSHARP公司。

人源乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、SUM1315MO2和人正常乳腺细胞MCF-10均在含有10%的胎牛血清和1%青霉素/链霉素溶液的1×DMEM培养基中培养，并放置于5% CO2体积分数的37 ℃恒温培养箱中，并每隔12 h在普通光学显微镜下观察细胞状态。

分别取出适量芒果醚和吉西他滨粉末溶于DMSO药物原液。再将芒果醚药物原液稀释配成16、20、24、28和32 μmol/L，将Gem药物原液稀释配成20、40和60 μmol/L。不加任何药物的细胞设为对照，浓度为0 μmol/L。

1.2 CCK-8细胞增殖和毒性实验

利用CCK-8试剂盒，严格按照试剂盒提供的说明进行操作来检测芒果醚和Gem两种药物对MCF-7、MCF-10、MDA-MB-231和SUM1315MO2细胞24 h后的细胞增殖和毒性情况。

1.3 Hoechst 33342染色实验

使用Hoechst 33342染液检测 Gem和芒果醚给药 24 h后MCF-7 细胞的凋亡情况。

1.4 MCF-7的细胞划痕迁移实验

利用枪头在培养MCF-7细胞的6 cm皿底沿直径线划1道痕迹，分别培养24 h后，取出细胞板，在倒置荧光显微镜下观察芒果醚、Gem给药24 h的划痕面积变化情况并拍照保存。

1.5 蛋白免疫印迹实验

蛋白免疫印迹试验(Western Blot，简称WB)检测方法：芒果醚、Gem 给药 MCF-7细胞24 h后，将细胞裂解制样，恒压(190 V，45 min)电泳结束后，湿法转膜(100 V，80 min)，孵育一抗、二抗后拍照并保存。

2 结果与分析

2.1 芒果醚具有显著抑制乳腺癌细胞MCF-7生长活性

不同浓度的Gem和芒果醚24 h给药处理MCF-7、MCF-10、MDA-MB-231和SUM1315MO2等4种细胞后，评估乳腺癌细胞的生存情况。如图2(a)所示，芒果醚以剂量依赖性方式显著降低了MCF-7细胞存活率，但是给药浓度超过24 μmol/L时，细胞生存率基本没有变化，因而选取16、20和24 μmol/L等3个浓度进行研究。进一步实验确定MCF-7细胞给药24 h的IC50为20 μmol/L。如图2(b)所示，当Gem以60 μmol/L的浓度作用24 h时，细胞存活率约为50%，即 Gem的IC50值为24 h的60 μmol/L。图2还表明，芒果醚对MCF-10、MDA-MB-231和SUM1315MO2等3种细胞的毒性很低，Gem对MCF-7、MDA-MB-231和SUM1315MO2等3种细胞都有活性抑制，对MCF-10细胞影响很低。本实验主要探究芒果醚的作用，后续实验只选择MCF-7细胞作为研究对象。

2.2 芒果醚与Gem可以诱导MCF-7细胞凋亡

图3所示为芒果醚给药处理MCF-7细胞可诱发产生凋亡小体，并存在剂量依赖现象，即随着给药浓度升高，芒果醚对细胞凋亡诱导作用随之加强，凋亡小体增多。不同的是，在相同给药时间内芒果醚作用后诱导产生的凋亡小体相较于Gem来说数量偏多，从而也反映了在较低给药浓度下芒果醚对MCF-7细胞的凋亡作用更强。

芒果醚和Gem以不同浓度给药处理MCF-7、MCF-10、MDA-MB-231、SUM1315MO2 这4种细胞24 h后的CCK-8检测结果，未给药组设为对照。(a)芒果醚给药4种细胞，浓度依次为0、16、20、24、28和32 μmol/L；(b)Gem给药4种细胞，浓度依次为0、20、40和60 μmol/L(***P< 0.0001、**P<0.001、*P<0.05)

(a)和(e)对照组，给药浓度为0；(b)～(d)芒果醚给药MCF-7，浓度依次为16、20和24 μmol/L；(f)～(h)Gem给药MCF-7，浓度依次为20、40和60 μmol/L

2.3 芒果醚可促发乳腺癌细胞MCF-7的凋亡途径

根据之前得到的IC50数值及凋亡小体染色结果，可针对细胞凋亡信号通路相关蛋白进行Western Blot检测。Bcl-2、Precaspase 9、Bax和Cytochrome C这4种蛋白因子是细胞凋亡信号通路上的关键信号分子，通过检测给药前后这4种蛋白因子的变化情况对芒果醚可致MCF-7细胞凋亡的分子机制做初步判断。图4显示芒果醚和Gem都可以下调Bcl-2和Precaspase 9的表达，上调Bax和Cytochrome C蛋白表达，并且以剂量依赖性方式发生显著变化。这些检测结果说明Gem和芒果醚致死MCF-7细胞与细胞凋亡信号通路息息相关。

(a)芒果醚给药MCF-7，浓度依次为0、16、20和24 μmol/L；(b)Gem给药MCF-7，浓度依次为0、20、40和60 μmol/L。未给药组设为对照；给药时间为24 h

(a)芒果醚作用MCF-7细胞的划痕实验，给药浓度为0、16、20和24 μmol/L；(b)Gem作用MCF-7细胞的划痕实验，给药浓度为0、20、40和60 μmol/L；(c)两种化合物给药24 h后的细胞划痕愈合面积定量分析图。未给药组设为对照

2.4 芒果醚可抑制MCF-7细胞迁移

如图5(a)和图5(b)所示，未给药组的划痕处的伤口愈合面积明显大于其他给药组，各给药组的伤口愈合面积随着时间和给药浓度增加而出现划痕处细胞迁移量减少的现象，表现为愈合面积减小。如图5(c)所示，对给药前后划痕面积变化的定量分析中发现，24 h后未给药组划痕面积很小，伤口愈合面积几乎覆盖了划痕面积，而给药组24 h后的划痕面积就趋于给药之前的初始划痕面积。因此，芒果醚与Gem给药细胞的划痕面积变化，表明两种药物都可以抑制MCF-7细胞迁移。

3 讨论与结论

寻找新的有前景的癌症治疗药物已成为热点问题[18]。自然界物种丰富且环境复杂，是潜在活性天然药物的宝库，目前这些天然资源已为全球数百万人提供着一线药物[19-22]。靶向药物成为乳腺癌化疗药物的首选，如紫杉醇及其半合成衍生物等已在临床治疗中取得了显著效果[23]。一般来说，天然药物作为乳腺癌临床治疗药物仍存在很大不确定性。这些因素包括如何提高生物利用度、增强活性、构建靶向给药系统等[24]。这些情况需要通过不同专业科学家共同努力来解决。

本研究对从山竹果实内提取的一种芒果醚进行了抗肿瘤活性的分析，发现对乳腺癌细胞MCF-7具有较好的增殖抑制、促发凋亡和抑制细胞迁移的效果。山竹“芒果醚”给药处理MCF-7细胞24 h后，IC50值为20 μmol/L，出现凋亡小体，具有剂量和时间依赖现象。同时，芒果醚可促发细胞凋亡信号，WB检测结果显示，Bcl-2剂量依赖性下调，而Bax上调，Cytochrome C显著上调，Precaspase-9也明显下调，这表明其可通过促发线粒体依赖性凋亡途径而抑制了MCF-7增殖。另外，划痕实验结果显示，芒果醚可有效减弱MCF-7细胞迁移。

本研究明确了山竹“芒果醚”可抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖、促发凋亡和抑制迁移等现象，但其分子机制仍需要更为深入的探讨，本课题正积极开展这项工作。另外，本研究显示，芒果醚对MCF-7细胞(ER+/PR+/P53+/-)作用明显，但是对MDA-MB-231(ER-/PR-/HER2-)和SUM1315MO2(ER-/PR-/TP53+)细胞无明显作用，表明芒果醚抑制乳腺癌具有特异性，但仍不明确，有待进一步探析。了解芒果醚药物靶点和作用机制，对于开发芒果醚潜在抗乳腺癌意义重大。