miR-29对GnRH基因启动子区特定位点甲基化的影响研究

王 欣， 李晓宁， 陈佳贤， 陈 贞， 肖君华， 李 凯， 周宇荀

(东华大学 生物科学与技术研究所, 上海 201620)

人类和小鼠的miR-29家族由miR-29a、miR-29b-1、miR-29b-2和miR-29c组成[1]。研究[2]发现，miR-29家族在神经元分化、突触生长及记忆的形成等相关生理过程中发挥了重要的生物学功能。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，是基因组DNA在DNA甲基化转移酶的作用下使CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶(C)转化为5′端甲基胞嘧啶(mC)的过程[3]。基因启动子区域CpG岛的甲基化是抑制基因表达的重要途径。与DNA甲基化密切相关的基因有以下两类：DNA甲基转移酶基因DNMT3A/B和DNA羟甲基化酶基因TET1/2/3，其中DNMT3A/B主要介导CpG位点发生甲基化[4]，而TET蛋白可使5-甲基胞嘧啶(5-mC)羟化生成5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)，启动DNA去甲基化过程[5]。已有研究[6]表明，DNMT3A/B和TET1/2/3均为miR-29的靶基因，Takada等[7]研究发现miR-29b可通过靶向Dnmt3a/b进而调控小鼠原始生殖细胞PGCs中基因组DNA的甲基化。Zhang等[8]发现miR-29可直接靶向Tet1/2/3的3'UTR，实现调控5-mC和5-hmC的动态转化，从而调控胚胎发育过程中的表观遗传修饰。

促性腺激素释放激素(GnRH)是由下丘脑分泌的一种十肽激素，是参与下丘脑-垂体-性腺轴调控的关键激素[9-10]。Kim等[11]将荧光素酶报告基因置于GnRH启动子下游构建转基因小鼠，发现携带转录起始位点到-1 005 bp的启动子区域的小鼠卵巢中荧光素酶活性最高。Kurian等[12]则在研究恒河猴GnRH神经元发育过程时发现，包括GnRH基因在内的很多基因都存在明显的CpG岛低甲基化现象。

实验室前期研究发现，在小鼠下丘脑来源的神经元的GT1-7细胞中敲除miR-29可使GnRH的表达量提高2倍左右[13]，而miR-29通过靶向Dnmt3a/b和Tet1/2/3影响GnRH启动子区域的甲基化水平是其参与调控GnRH表达的可能机制之一。为了解该调控机制是否存在，选取GnRH启动子上游-1005 ～ +1区域作为目的区段，利用二代测序技术检测GnRH启动子区域的7个CpG位点甲基化程度，并利用CRISPR-dCas9技术在甲基化水平差异明显的位点CpG6分别富集Dnmt3a和Tet1酶，研究与miR-29相关的这两种酶对该CpG6位点和其他CpG位点甲基化程度的影响，以及该影响与GnRH表达水平的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

CRISPR-dCas9载体、去除Cas9蛋白的42230-EGFP载体、鼠源GT1-7及miR-29敲除GT1-7细胞、Hepa1c1c-7细胞均由本实验室保存提供。

1.1.2 主要试剂与仪器

DMEM高糖培养基、胰酶、PBS(上海元象生物科技有限公司)；胎牛血清FBS、Opti-MEM培养基(Gibco，美国)；LipofectamineTM3000(Invitrogen，美国)；AgeI-HF、BbSI核酸内切酶(New England Biolabs，美国)；DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；动物基因组DNA快速抽提试剂盒(上海生工生物有限公司)；逆转录试剂盒(Thermo Scientific，美国)；一步定向克隆试剂盒、Novostart®SYBR qPCR SuperMix Plus(近岸蛋白质科技有限公司)；MPXTaqDNA聚合酶(苏州新海生物股份有限公司)；PCR引物由苏州泓讯生物科技有限公司合成。

NanoDrop微量紫外分光光度计(Thermo Scientific，美国)；PCR扩增仪(BIO-RAD，美国)；倒置相差荧显微镜(OLYMPUS，日本)；7500型ABI Real-Time PCR System(Applied Biosystems Inc，美国)；Partec CyFlow®Space流式细胞仪(Partec，德国)。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取及重亚硫酸盐修饰

按照基因组DNA抽提说明书提取细胞DNA，用NanoDrop紫外分光光度计测定浓度后保存至-20 ℃。根据重亚硫酸盐转化试剂盒说明书，对已获取的每个基因组DNA样本各取1 μg进行转化处理，转化程序：95 ℃ 10 min，64 ℃ 60 min。

1.2.2 BSP法扩增GnRH启动子目的区段

利用Methyl Primer软件和Oligo 7软件在线设计BSP引物，分成5个区段(M1、M2、M3、M4、M5)PCR扩增GnRH基因启动子-1005～+1的7个CpG位点。反应条件：95 ℃预变性 15 min；98 ℃ 变性15 s，55 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸30 s，共40个循环；72 ℃ 再延伸10 min。扩增区段详见图1，BSP引物序列见表1。

图1 BSP法扩增GnRH启动子目的区段

表1 BSP引物

1.2.3 CRISPR-dCas9-Dnmt3a/Tet1过表达载体的构建

利用NCBI网站找到鼠源Dnmt3a的编码区序列(CDS)并设计含有同源臂的引物序列，Trizol法提取小鼠GT1-7细胞RNA，经逆转录得到cDNA后，PCR获得含有同源臂的Dnmt3a的CDS序列，利用同源重组的方法构建重组载体CRISPR-dCas9-Dnmt3a(dCas9-Dnmt3a)。同样获取Tet1的催化结构域序列(CD)构建Tet1过表达载体CRISPR-dCas9-Tet1(dCas9-Tet1)，重组载体示意图及引物序列见图2和表2。载体送上海生工生物有限公司测序鉴定后使用。

图2 CRISPR-dCas9-Dnmt3a(a)/Tet1(b)过表达载体的构建

表2 同源重组PCR引物序列

1.2.4 42230-sgRNA-EGFP载体的构建

针对GnRH启动子区的CpG6位点和CpG2位点分别设计sgRNA(sgRNA-CpG6、sgRNA-CpG2)，针对Sp1基因的sgRNA-Sp1用作实验对照，将sgRNA构建到42230-EGFP载体上获得重组载体，sgRNA设计及引物序列详情见图3和表3。载体送上海生工生物有限公司测序鉴定后使用。

sgRNA-Sp1由本实验室保存提供

1.2.5 CRISPR-dCas9-Dnmt3a/Tet1载体和42230-sgRNA-EGFP载体的共转染

按照Lipo3000转染试剂说明书将成功构建好的CRISPR-dCas9-Dnmt3a/Tet1质粒和42230-sgRNA-EGFP质粒共转染至6孔板培养的miR-29KO-GT1-7和GT1-7细胞中。转染方案如下：每孔转染质粒总量2 μg，miR-29KO-GT1-7组(实验组共4个)：dCas9-Dnmt3aonly；dCas9-Dnmt3a+sgRNA-Sp1；dCas9-Dnmt3a+sgRNA-CpG2；dCas9-Dnmt3a+sgRNA-CpG6；miR-29KO-GT1-7对照组：未经处理的野生型miR-29KO-GT1-7细胞。GT1-7组(共4个实验组)：dCas9-Tet1 only；dCas9-Tet1+sgRNA-Sp1；dCas9-Tet1+sgRNA-CpG2；dCas9-Tet1+sgRNA-CpG6；GT1-7对照组：未经处理的野生型GT1-7细胞。各组培养24 h后观察绿色荧光，48 h后收集细胞用于流式分选。

1.2.6 流式细胞分选技术富集阳性细胞

将6孔板中培养的各组细胞经过胰酶消化后用500 μL培养基重悬，利用Sysmex CyFlow流式细胞仪上机分选，分选得到的各组阳性荧光细胞一半细胞量用于二代测序检测位点甲基化状态，另一半则用于实时荧光定量PCR检测GnRH表达变化。

1.2.7 二代测序数据分析

为确定每个CpG位点的甲基化程度，将测序平台收集的亚硫酸盐转化后DNA测序读段与参考区段原始序列比对，每个位点C的总数(甲基化C)和T的总数(未发生甲基化C)的比例则反映各个CpG位点的甲基化水平(%)，即methylation ration of each CpG site = C/(C+T)。

1.2.8 逆转录和实时荧光定量PCR

Trizol法提取实验细胞总RNA，每组取1 μg经DNA酶处理的RNA，用逆转录试剂盒逆转录成cDNA产物。cDNA稀释5倍后用作实时荧光定量PCR模板，利用ABI7500荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR检测，结果采用2-ΔΔCt值分析基因相对表达量。

1.2.9 统计学方法与作图

实验中关于基因表达量的检测均重复3次以上，数据使用GraphPad Prism 7.0软件进行结果分析和绘图，各组之间比较采用t-test，其中P<0.05(*)表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 miR-29敲除对GnRH、Dnmt3a及Tet1基因表达量的影响

GnRH在GT1-7、miR-29KO-GT1-7、Hepa1c1c-7细胞中的表达差异见图4(a)。其中，在Hepa1c1c-7中，GnRH表达量过低(P<0.001)，表明该基因的表达具有组织特异性，miR-29KO-GT1-7细胞中GnRH表达量较GT1-7中表达显著上升(P<0.05)。图4(b)中，miR-29KO-GT1-7细胞中Dnmt3a、Tet1的表达相比于GT1-7细胞显著增加(Dnmt3a：P<0.001；Tet1：P<0.01)。

* P<0.05；** P<0.01；*** P<0.001

2.2 二代测序数据分析GT1-7、miR-29KO-GT1-7、Hepa1c1c-7细胞中GnRH启动子区域CpG位点甲基化程度

GT1-7、miR-29KO-GT1-7、Hepa1c1c-7细胞中GnRH启动子目的区段的7个CpG位点甲基化程度详见表3。结果显示，miR-29KO-GT1-7的CpG6位点甲基化程度最低，为51.28%，较其他组下降约20%～40%。

表3 GT1-7、miR-29KO-GT1-7和Hepa1c1c-7细胞中GnRH启动子区域甲基化结果

2.3 二代测序检测流式分选的miR-29KO-GT1-7及GT1-7实验组阳性细胞中的GnRH启动子区域甲基化程度

miR-29KO-GT1-7及GT1-7实验组阳性细胞中GnRH启动子区域甲基化状态详见表4和表5。表4的miR-29KO-GT1-7实验组结果显示，载体转染后，各CpG位点都发生不同程度的改变，其中，变化最大的为dcas9-Dnmt3a+sgRNA-CpG6组的CpG6位点，较其他组增加约10%～20%。同样在表5的GT1-7实验组中，变化最大的是dCas9-Tet1+sgRNA-CpG6组的CpG6位点，较其他组下降约10%～20%。

2.4 实时荧光定量PCR检测流式分选的miR-29KO-GT1-7及GT1-7实验组阳性细胞中的GnRH表达变化

图5(a)所示，与对照组相比，miR-29KO-GT1-7实验组中GnRH的表达出现不同程度的变化，其中dCas9-Dnmt3a+sgRNA-CpG6组，GnRH变化最为显著，下降约40%(P<0.01)。同样在图5(b)中对比发现，GnRH表达有不同程度的上升，其中dCas9-Tet1+sgRNA-CpG6组变化较大，上升约50%(P<0.05)。

表4 miR-29KO-GT1-7实验组阳性细胞中GnRH启动子区域CpG位点的甲基化程度

表5 GT1-7实验组阳性细胞中GnRH启动子区域CpG位点的甲基化程度

*P<0.05；** P<0.01；***P<0.001

3 讨论与结论

本实验室前期研究发现，在GT1-7细胞中敲除miR-29可导致GnRH表达上升，转录激活因子Tbx21作为miR-29的靶基因，可通过直接与GnRH启动子区域结合和促进转录激活因子Dlx1的表达间接影响GnRH的表达[13]。然而，在GT1-7细胞中过表达Tbx21并不能完全达到miR-29敲除导致的GnRH表达提高的程度，这提示除了Tbx21以外，miR-29可能还通过其他的靶基因影响GnRH的表达，比如可能通过靶向Dnmt3a/b、Tet1/2/3等DNA甲基化修饰酶调节GnRH的表达[14]。

DNA甲基化通常发生在富含CpG岛的启动子区域，细胞内基因组DNA甲基化水平由DNMT3A/B酶介导的甲基化和TET酶介导的去甲基化协同调控[15]。为了解miR-29是否能通过上述两类酶调控GnRH启动子区域CpG位点的甲基化程度影响GnRH的表达，我们在甲基化差异明显的CpG6位点附近设计sgRNA，利用CRISPR-dCas9技术特异性地在该位点分别富集miR-29的靶蛋白DNMT3A和Tet1后发现，这两种酶可引起CpG6位点甲基化程度显著上升或下降，同时GnRH的表达量也同步降低(P<0.01)或增加(P<0.05)。Aleksandar等[16]利用CRISPR-dCas9技术在IL6ST和BACH2基因的多个CpG岛区域富集Dnmt3a后发现，与单个sgRNA转染相比，多个sgRNA的共转染会导致基因启动子区域甲基化水平显著增加并抑制基因的表达。Choudhury等[17]同样利用该技术在BRCA1启动子多个CpG岛附近富集Tet1，使其启动子区域发生去甲基化，促进了基因表达。我们在其他的CpG位点之一进行同样的富集，并未观察到GnRH表达量的明显变化。Shimada等[18]在研究发作性睡病调控机制时发现，CCR3基因中单个位点甲基化是引起该病发生的候选区域之一，这表明单个CpG位点甲基化的改变也可影响基因的表达。因此，推测在GnRH基因的表达调控区，CpG6位点的甲基化状态相对于其他位点而言是一个更为敏感的调控位点。另外，该位点所处序列Tm值较低，在复制过程中可能更容易发生解链、结合转录因子和其他的DNA修饰酶等，更为精确的分子机制有待进一步实验验证。

本实验研究表明：miR-29可能通过其靶基因Dnmt3a和Tet1影响GnRH启动子调控区的甲基化程度，而这也是其参与调控GnRH表达的分子机制之一；特定CpG位点甲基化水平的改变会显著影响GnRH基因的表达，这为后续解析表观遗传修饰调控性发育的精细机制提供了新的依据。