牡荆苷对急性脑缺血大鼠大脑纹状皮质nNOS免疫表达的影响

刘 磊 吴一飞

(陕西中医药大学基础医学院，咸阳 712046)

急性脑缺血是临床常见的脑血管疾病，可导致相应神经元损害引发神经功能障碍[1]。研究发现，急性脑缺血实验大鼠脑皮层纹状区可在受到缺血缺氧性信息刺激后激活神经元一氧化氮合酶(nNOS)的表达，经免疫组化检测发现nNOS阳性神经元显著增多，且对维持炎性反应的发展、诱发并加重皮层纹状区神经元损伤具有至关重要的作用[2]。另有研究报道，急性脑缺血实验大鼠造模24 h后大脑皮层纹状体脱失明显，nNOS阳性神经元显著增多，其中大脑皮层纹状体是nNOS的主要来源，可损伤神经细胞，诱发胶质细胞坏死[3]。故在急性脑缺血治疗中应积极控制大脑纹状皮质nNOS阳性神经元的数量和活性。牡荆苷是从牡荆叶和牡荆子中提取的黄酮类化合物，在既往的报道中证实牡荆苷对急性脑缺血大鼠具有抗氧化应激活性和脑保护作用[4，5]。牡荆苷是否能够调控急性脑缺血大脑纹状皮质nNOS阳性神经元的数量和表达，以减少神经元细胞凋亡尚鲜有报道。本研究选取50只雄性SD大鼠开展实验，报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 50只SD雄性大鼠，SPF级，6～8周，体质量180～220 g，均购自西安交通大学医学实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK(陕)-2018001。

1.1.2试剂与仪器 牡荆苷(上海经科化学科技有限公司，纯度HPLC≥98%)；2%戊巴比妥钠(诺华制药有限公司)；磷酸盐缓冲液(武汉博士德生物公司)；4%多聚甲醛溶液(北京雷根生物技术有限公司)；2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液、兔抗鼠nNOS、β-actin，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(美国Sigma 公司)；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法(TUNEL)试剂盒(艾美捷科技有限公司)；TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)。

EG1150型石蜡包埋机、RM2235型组织切片机(德国Leica 公司)；BX53型光学显微镜(日本Olympus 公司)；905型恒温冰箱(美国Thermo 公司)；7500型荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)仪(美国Axygen公司)；50W-X8型转膜仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1分组和建模方法 将50只大鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组各10只，除假手术组外均采用线栓左侧大脑中动脉法建立急性脑缺血模型，具体操作：采用改良Longa法造模，选用白色日本尼龙鱼线(直径 0.23 mm)，在插入端蘸聚酯成光滑纺锤状，在距离插入端大约18 mm的位置进行标记[6]。取40 mg/kg 2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹腔麻醉，于颈部做正中切口，将左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉分离并暴露，对颈外动脉分支电凝，结扎并游离其主干远端。自颈外动脉残端起始部位将拴线插入，插入深入距离颈总动脉分叉处大约为17.5～18.5 mm，若遇到阻力则停止操作，将拴线固定并结扎缝合。假手术组操作过程同上，但不结扎栓线。大鼠清醒后，将同时具有以下3项者即为建模成功：①左侧Horner征，即眼裂变小、眼球下陷；②爬行时向右侧划圈且步态不稳；③提尾时右前肢内收屈曲，向右上方旋转。

1.2.2干预方法 确认建模成功后模型组和牡荆苷剂量组均立即予以干预，假手术同时予以干预，其中假手术组和模型组均给予0.01 ml/g体质量生理盐水腹腔注射，低、中、高剂量组分别给予1.62、3.24、6.48 μmol/kg牡荆苷溶于0.01 ml/g体质量生理盐水中腹腔注射(低剂量组所用剂量为牡荆苷的临床等效剂量，中剂量组、高剂量组所给剂量分别为牡荆苷临床等效剂量的2倍、4倍)，1次/d，连续3 d。

1.2.3干预前后神经行为学变化 以神经行为学评分表评价各组干预前后神经行为学变化，包括身体对称性、45°斜面爬行、步态、转圈、前肢对称性、强迫转圈、Whisker反应共7个项目，每个项目分别以0分表示正常，1分表示轻微异常，2分表示明显异常，3分表示显著异常，4分表示严重异常，共0～28分，评分越高认为神经行为学异常越严重[7]。

1.2.4TTC法检测脑梗死体积 所有大鼠干预后同1.2.1方法实施腹腔麻醉，解剖心脏，于左心室进针，将右心耳剪开以磷酸盐缓冲液灌注，待流出液体澄清后灌注4%多聚甲醛，多聚甲醛灌注量约和磷酸盐缓冲液灌注量相同。观察大鼠舌体和肝脏变化，完全变白后放置于冰块上断头并迅速取脑组织。在-20℃恒温冰箱中冷冻15 min，冠状位切5等份，放置于预热的2% TTC溶液中，37℃避光保存0.5 h，红色为正常脑组织，白色为脑梗死组织，脑梗死体积(%)=苍白区质量/总质量×100%。

1.2.5TUNEL法检测缺血性神经元细胞凋亡率 对脑梗死组织脱水、包埋、连续切片(层厚4 μm)，对切片采用TUNEL试剂盒检测缺血性神经元细胞的凋亡情况，并以光学显微镜观察。

1.2.6ABC免疫细胞化学法检测大脑纹状皮质nNOS阳性神经元 按照上述方法做切片，60℃烘烤1.5 h，二甲苯透明处理，梯度浓度酒精水化处理。加入0.1%过氧化氢封闭，室温下等待0.5 h，加入1∶10第二抗体来源的正常山羊血清，室温下等待1 h。加入1∶2 000兔抗nNOS 多克隆抗体，4℃下等待48 h。PBS冲洗后，给予1∶100 ABC复合物，4℃下等待24 h。PBS冲洗，加入显色液(0.05%显色剂+0.01%过氧化氢)，显色5～7 min，以PBS终止染色，并冲洗。乙醇脱水，二甲苯透明后封片，以光学显微镜观察染色结果，并将图像信息传输至IPP5.0软件分析系统，测得nNOS积分光度值(IOD)。

1.2.7qRT-PCR检测大脑纹状皮质nNOS mRNA表达方法 参照《大鼠脑立体定位图谱》[8]中标记的具体解剖位置取大脑纹状皮质组织约1 mm×1 mm×1 mm，清洗并保存于-80℃的恒温冰箱中，按照TRIzol说明书方法提取总RNA，取1 μl将其作为模板反转录为cDNA，以β-actin mRNA作为内参，nNOS引物序列：上游5′-GCGCGGTTACGACTGCT-AGCTG-3′；下游5′-ACTGCTCGATATCTAGTCAAAC-3′；β-actin引物序列：上游5′-TCCGATATAGCTAAACTAGCTA-3′；下游5′-CGCTAGCTAGCTAGCTAG-TTGA-3′。常规配置反应体系，实施扩增反应，PCR反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 20 s， 72℃ 20 s，共进行35个循环后，72℃ 5 min。以β-actin mRNA对反应产物进行定量校正和判定，将其拷贝数作为矫正基数，将nNOS mRNA的循环阈值(Ct)值与β-actin mRNA的Ct值求差，可获得ΔCt，2-ΔΔCt即为nNOS mRNA的相对表达量。

1.2.8Western blot法检测大脑纹状皮质nNOS蛋白表达 按照上述方法取大脑纹状皮质组织约 1 mm3，加入液氮研磨，匀浆后离心取等量蛋白样品进行电泳、转膜和封闭处理，根据PVDF膜蛋白标记分子量，在其相应分子量标记位置剪取nNOS蛋白(155×103)、β-actin(37×201)条带。分别加入兔抗鼠nNOS、β-actin(1∶1 000)4℃过夜，并加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室温摇床孵育2 h，曝光后以图像分析软件分析nNOS蛋白表达。

2 结果

2.1各组干预前后神经行为学评分对比 模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组分别有2只、3只、2只和1只建模失败，假手术组有1只死亡。假手术组干预前后神经行为学评分无变化(P>0.05)，模型组干预后较干预前增加(P<0.05)，牡荆苷剂量组均较干预前降低(P<0.05)，且干预后高剂量组<中剂量组<低剂量组<模型组，每2组间差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组干预前后神经行为学评分对比分)Tab.1 Comparison of neurobehavioral scores before and after intervention in each

2.2各组脑梗死体积对比 假手术组无梗死灶，除假手术组外，其余4组脑梗死体积对比差异有统计学意义(P<0.05)，其中高剂量组<中剂量组<低剂量组<模型组，每剂量组间差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组脑梗死体积对比Tab.2 Comparison of volume of cerebral infarction in each

2.3各组脑梗死组织缺血性神经元细胞凋亡率对比 假手术组无缺血性神经元细胞凋亡，模型组可见大量TUNEL染色阳性细胞，杜荆素剂量组TUNEL染色阳性细胞均减少，且以高剂量组最少，见图1；模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组缺血性神经元细胞凋亡率对比差异有统计学意义(P<0.05)，其中高剂量组<中剂量组<低剂量组<模型组，每剂量组间对比差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组脑梗死组织缺血性神经元细胞凋亡率对比Tab.3 Comparison of apoptotic rates of ischemic neurons in cerebral

图1 各组脑梗死组织TUNEL染色结果(×200)Fig.1 TUNEL staining results of cerebral infarction tissues in each group(×200)

2.4各组大脑纹状皮质nNOS阳性神经元定性和定量结果对比

2.4.1定性结果 大脑纹状皮质nNOS阳性神经元多呈棕褐色染色，阳性物质主要位于细胞浆内，胞核透亮，阳性细胞的形态多变，体积小，且阳性细胞体多呈梭形或圆形，每个细胞可见1～3个纤细且长的突起，伸向脑缺血病灶方向。假手术组大脑纹状皮质nNOS阳性神经元稀疏、散在，阳性染色较浅；高剂量组大脑纹状皮质nNOS阳性神经元稍密集，着色稍深；中剂量组大脑纹状皮质nNOS阳性神经元密集，着色加深；低剂量组大脑纹状皮质nNOS阳性神经元密集分布；模型组大脑纹状皮质nNOS阳性神经元分布最为密集，见图2。

图2 大脑纹状皮质nNOS免疫阳性神经元检测(×100)Fig.2 Detection of nNOS immunoreactive neurons in striate cortex of brain (×100)

2.4.2定量结果 各组大脑纹状皮质nNOS IOD值对比差异均有统计学意义(P<0.05)，其中假手术组 <高剂量组 <中剂量组<低剂量组<模型组， 每剂量组间对比差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 各组大脑纹状皮质nNOS IOD值对比Tab.4 Comparison of nNOS IOD values in striate cortex of brain in each

2.5各组大脑纹状皮质nNOS mRNA表达对比 各组大脑纹状皮质nNOS mRNA表达对比差异均有统计学意义(P<0.05)，其中假手术组<高剂量组<中剂量组<低剂量组<模型组，每两组间对比差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 各组大脑纹状皮质nNOS mRNA表达Tab.5 nNOS mRNA expression in the striate cortex of brain in each

2.6各组大脑纹状皮质nNOS 蛋白表达对比 各组大脑纹状皮质nNOS 蛋白表达对比差异均有统计学意义(P<0.05)，其中假手术组<高剂量组<中剂量组<低剂量组<模型组，每两组间对比差异均有统计学意义(P<0.05)，见表6、图3。

表6 各组大脑纹状皮质nNOS 蛋白表达Tab.6 Expressions of nNOS protein in the striate cortex of brain in each

图3 各组大脑纹状皮质nNOS 蛋白表达检测Fig.3 Detection of nNOS protein expression in cerebral striate cortex of each groupNote:1.Sham operation group;2.High dose group;3.Medium dose group;4.Low dose group;5.Model group.

3 讨论

急性脑缺血是常见的致死致残疾病，在脑血管疾病中的构成比已超过85%[9]。急性脑缺血可引发神经元损伤，国内外报道的可能机制包括能量衰竭、酸中毒、自由基损伤、兴奋性毒性损害、免疫失衡和炎症反应等[10，11]。有研究指出，急性脑缺血患者神经元损伤过程中免疫失衡是诱发炎症反应的重要条件，以nNOS阳性神经元数量增多和功能激活最为多见，NOS是催化产生内源性NO的唯一酶类，而内源性NO可作为中枢神经系统细胞间的信使分子，在神经元电生理活动中起到重要的调控作用[12]。NOS可分为原生型和诱导型，前者又可分为神经元型和内皮型，各自执行不同的功能，其中nNOS可能是参与急性脑缺血神经元损伤的重要因子[13]。故调控急性脑缺血组织中nNOS的表达可能是控制病情的重要途径。

本次研究显示，除假手术组外，模型组神经行为学评分、脑梗死体积、脑梗死组织缺血性神经元细胞凋亡率均高于其余3组，且在3组间对比显示，高剂量组<中剂量组<低剂量组，表明牡荆苷在急性脑缺血大鼠中应用能够改善神经行为学、减少脑梗死体积、降低缺血性神经元细胞凋亡率，且高剂量牡荆苷的作用效果最佳，中剂量牡荆苷的作用效果明显优于低剂量组。牡荆苷属于天然黄酮类药物，具有抗氧化应激、抗肿瘤、抗炎症反应等作用，在既往的研究报道中已证实该药物可调控Toll样受体4(TLR4)和核因子κB(NF-κB)mRNA及蛋白表达，控制氧化应激和炎症反应，发挥脑保护作用[14]。另有研究指出，牡荆苷可改善急性脑缺血大鼠局部组织的能量代谢，从而可优化局部微环境，为病情控制和神经功能的改善提供依据[15]。国外一项报道中证实，牡荆苷可缓解缺血缺氧性损伤大鼠模型的神经元损伤程度，抑制神经元细胞线粒体凋亡，且可改善其神经行为学[16]。因此，在急性脑缺血大鼠中牡荆苷可发挥脑保护作用。但是关于牡荆苷对神经免疫的作用报道尚少，既往研究推测其对神经免疫具有双向调控作用，而其是否能够调节急性脑缺血局部组织的神经免疫表达仍需进一步探讨[17]。

此外，本研究还发现，大脑纹状皮质nNOS阳性神经元定性和定量结果均显示，模型组最多，低剂量组次之，中剂量组稍少，高剂量组更少，假手术组最少，可知在急性脑缺血大鼠大脑纹状皮质nNOS免疫阳性神经元数量显著增多，给予牡荆苷可降低其数量，且浓度越高效果越佳；在进一步的对比结果中显示，大脑纹状皮质组织nNOS mRNA和蛋白表达量组间对比，模型组>低剂量组>中剂量组>高剂量组>假手术组，可知在急性脑缺血发生过程中大脑纹状皮质nNOS mRNA和蛋白表达量显著增高，给予牡荆苷干预后可下调其表达，且高剂量牡荆苷的作用最佳。研究发现，在急性脑缺血早期，大脑皮质多个区域均可见nNOS免疫阳性神经元，且Western blot和免疫组化法检测结果均发现其表达水平显著增强，以皮层纹状区、海马始层、腔隙层等较为常见，且大脑纹状皮质中其免疫阳性神经元最多，蛋白表达量最高，是其他区域免疫阳性神经元的主要来源[18]。在进一步的研究中显示，缺血早期上述区域nNOS免疫阳性神经元数量与神经元细胞凋亡率呈正相关，推测nNOS免疫表达增强是导致上述区域成为缺血易损区的重要原因。Shao等[19]的报道指出，大鼠大脑纹状皮质nNOS阳性神经元对缺血缺氧性损伤非常敏感，在其刺激下可显著增加阳性表达数量，并推测很可能参与脑组织损伤和神经缺损的坏死病变过程。结合本研究结果，推测牡荆苷可减少急性脑缺血大鼠大脑纹状皮质nNOS阳性神经元数量，抑制其表达，并下调其mRNA和蛋白表达。

综上所述，牡荆苷可改善急性脑缺血大鼠的神经行为学，减小脑梗死体积，降低缺血性神经元细胞凋亡率，且剂量越高作用越佳，推测与减少达到大脑纹状皮质组织nNOS免疫阳性神经元数量，抑制其免疫表达，下调其mRNA和蛋白表达有关，为急性脑缺血患者的临床治疗研究提供了新方向。但关于牡荆苷对皮层纹状区nNOS免疫表达的调控机制仍需要深入探讨，可作为进一步的研究方向。