miR-155/SOCS1/NF-κB通路在快速眼动睡眠剥夺大鼠免疫失衡中的作用机制①

秦 冰 常淑莹 刘芳翡 李 莉 胡亚琼

(河南医学高等专科学校，郑州 451191)

睡眠被认为是维持和修复免疫功能必不可少的生理过程，睡眠干扰可影响机体健康从而造成各项生理功能紊乱[1]。影响睡眠的信号通路对于睡眠剥夺的机制尚未明确。miRNA在转录后水平上调控靶基因的表达，miR-155在免疫反应中是巨噬细胞、树突状细胞甚至上皮细胞中先天免疫应答的关键调节剂，在结肠炎T淋巴细胞和B淋巴细胞中发挥作用[2]。下游通路细胞因子信号传送阻抑物(suppressor of cytokine signaling，SOCS1)/核因子κB(nuclear factor kappa beta，NF-κB)在免疫过程中可调节结肠炎的T细胞极化和扩增来调节黏膜免疫系统影响免疫功能，推测，miR-155/SOCS1/NF-κB通路可能影响睡眠[3]。基于此，本研究建立快速眼动(rapid eye movement，REM)睡眠剥夺大鼠模型，检测miR-155/SOCS1/NF-κB对REM睡眠剥夺免疫方面的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 清洁级健康SD大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号： SCXK(京)2018-0013，动物使用许可证号：SYXK(京)2018-0037，动物质量合格证号：20190301507，体质量(200±20)g，所有大鼠均在温度(25±0.5)℃、湿度(55±5)%、12 h光照/12 h黑暗实验动物中心常规饲养。本动物实验经河南医学高等专科学校动物伦理委员会批准，伦理审批号：IACUC-20190108007。

1.1.2主要试剂 改良平台(直径6 cm，高8 cm)；日光灯(40 W，深圳市长忆光电科技有限公司)；HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120)；大鼠ELISA肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、IL-1、IL-6试剂盒、一抗SOCS1(抗兔)、NF-κB(抗兔)、内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(抗兔)、二抗羊抗兔(美国abcam公司，货号分别为：ab208348、ab79277、ab100712、ab3691、ab220803、ab181602、ab6721)；BCA试剂盒、PVDF膜(碧云天生物科技有限公司，货号分别为：P0012S、FFP32)；miRVana miRNA提取试剂盒(美国Ambion公司，货号：AM1552)；2×Hi SYBR Green QPCR Mix(日本TaKaRa公司，货号：ARR041A)；二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色试剂(索来宝科技有限公司，货号：DA1010)。引物由上海生工生物公司合成。

1.1.3主要仪器 XK-SW002普通光学显微镜(美国Olympus公司)；7500实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)仪(美国ABI公司)；5200蛋白凝胶成像仪(上海Tanon公司)。

1.2方法

1.2.1REM睡眠剥夺模型建立 30只大鼠分成3组，对照组、1 d REM睡眠剥夺组、7 d REM睡眠剥夺组，每组10只。按参考文献[4]方法制备REM睡眠剥夺模型，利用改良多平台睡眠法，1 d REM睡眠剥夺组日光灯照射持续1 d REM睡眠剥夺，7 d REM睡眠剥夺组日光灯照射持续7 d REM睡眠剥夺，对照组保持12 h光照/12 h黑暗。其余条件与正常饲养条件相同，且各组之间无影响。

1.2.2大鼠认知能力测试 采用迷宫法测试大鼠认知能力，模型建立前对所有动物进行Y型迷宫箱训练，选择活跃、对电击敏感、逃避反应迅速大鼠进行实验。对大鼠进行空间训练和学习测试，迷宫中先适应3～5 min，然后无规则次序变换安全区。电击后大鼠逃入安全区，然后以此为起点进行下一次测试，每次训练20次，共3 d。测试大鼠足底通电后10 s内一次性逃入安全区为正确反应，否则为错误反应。记录大鼠每日出现错误反应次数。

1.2.3ELISA检测血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平 将上述静脉血混合均匀，3 000 r/min离心10 min，收集血清后分装待用。实验时严格按照大鼠ELISA TNF-α、IL-1、IL-6试剂盒说明书步骤进行。

1.2.4HE检测大鼠海马组织、前额叶皮质区形态 模型处理结束后，1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，肝素钠抗凝管抽取静脉血，迅速断头取脑，冰上分离海马组织、前额叶皮质区组织，部分置于-80℃冰箱保存待用，部分置于4%多聚甲醛中固定。将4%多聚甲醛中固定的组织取出，酒精中脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、凝固后切片，切片厚度为5 μm。切片后HE染色，苏木精染色、乙醇伊红复染，酒精中脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜拍照。

1.2.5qRT-PCR检测大鼠海马组织、前额叶皮质区组织中miR-155表达水平 采用qRT-PCR检测大鼠海马组织、前额叶皮质区中miR-155表达水平。组织碾碎，RNA提取试剂盒提取组织中总RNA，反转录得cDNA。qRT-PCR仪对miR-155、内参进行扩增。引物序列见表1。cDNA上样量1 μl(50 ng/μl)，10 μmol/L 上下游引物各0.5 μl，miScript SYBR®Green Mix 10 μl，ddH2O 8.0 μl。反应条件：95℃、60 s；95℃、30 s，60℃、35 s，45个循环。采用2-ΔΔCt法对组织中miR-155表达水平进行定量分析。

表1 miR-155及内参引物Tab.1 miR-155 and internal reference primers

1.2.6Western blot检测海马组织、前额叶皮质区组织中SOCS1、NF-κB蛋白表达 -80℃冰箱待用组织碾碎，TRizol法提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白总浓度，每孔上样30 ng，PAGE胶分离蛋白质，PVDF膜转膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h；对应加入一抗SOCS1、NF-κB、GADPH(1∶5 000)，4℃孵育过夜；对应加入二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h。DAB显色试剂显色，蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。

2 结果

2.1睡眠剥夺对大鼠认知能力影响 与对照组相比，1 d、7 d REM睡眠剥夺组错误反应次数增加(P<0.05)；与1 d REM睡眠剥夺组相比，7 d REM睡眠剥夺组错误反应次数增加(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠认知能力比较Tab.2 Comparison of cognitive ability of three groups of

2.2睡眠剥夺对大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平影响 与对照组相比，1 d、7 d REM睡眠剥夺组血清中TNF-α、IL-1、IL-6升高(P<0.05)；与1 d REM睡眠剥夺组相比，7 d REM睡眠剥夺组血清中TNF-α、IL-1、IL-6升高(P<0.05)。见表3。

表3 3组大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平比较Tab.3 Comparison of serum TNF-α，IL-1 and IL-6 levels in three groups of

2.3睡眠剥夺对大鼠海马组织、前额叶皮质区形态影响 对照组大鼠海马组织、前额叶皮质区细胞排列正常、分布均匀。1 d REM睡眠剥夺组海马组织、前额叶皮质区细胞均出现神经元丢失、肿胀、变性和死亡，以及炎症细胞浸润和神经胶质细胞增殖现象。7 d REM睡眠剥夺组海马组织、前额叶皮质区细胞均出现大量神经元丢失，肿胀，变性和死亡，以及炎症细胞浸润和神经胶质细胞增殖现象。见图1。

图1 HE检测大鼠海马组织、前额叶皮质区形态Fig.1 Morphology of hippocampus and prefrontal cortex of rats detected by HENote:A，D.Control group;B，E.1 d REM sleep deprivation group;C，F.7 d REM sleep deprivation group.The base drawing is enlarged drawing of the upper box respectively (magnification，×400).

2.4睡眠剥夺对大鼠海马组织、前额叶皮质区组织中miR-155表达水平影响 前额叶皮质区组织中miR-155差异无统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，1 d、7 d REM睡眠剥夺组海马组织中miR-155升高(P<0.05)；与1 d REM睡眠剥夺组相比，7 d REM睡眠剥夺组海马组织中miR-155升高(P<0.05)。见表4。

表4 3组大鼠海马组织、前额叶皮质区组织中miR-155表达水平比较Tab.4 Comparison of miR-155 expression levels in hippocampus and prefrontal cortex of three groups of

2.5睡眠剥夺对大鼠海马组织、前额叶皮质区组织中SOCS1、NF-κB蛋白表达影响 与对照组相比，1 d、7 d REM睡眠剥夺组海马组织、前额叶皮质区组织中SOCS1水平降低(P<0.05)；7 d REM睡眠剥夺组海马组织、前额叶皮质区组织中，1 d REM睡眠剥夺组前额叶皮质区组织中NF-κB水平升高(P<0.05)。与1 d REM睡眠剥夺组相比，7 d REM睡眠剥夺组海马组织、前额叶皮质区组织中SOCS1水平降低(P<0.05)；NF-κB水平升高(P<0.05)。见图2、表5。

表5 3组大鼠海马组织、前额叶皮质区组织中SOCS1、NF-κB蛋白表达比较Tab.5 Expressions of SOCS1 and NF-κB in hippocampus and prefrontal cortex of three groups of

图2 Western blot检测大鼠海马组织、前额叶皮质区SOCS1、NF-κB蛋白表达Fig.2 Western blot detection of SOCS1 and NF-κB protein expression in hippocampus and prefrontal cortex of ratsNote:1.Control group;2.1 d REM sleep deprivation group;3.7 d REM sleep deprivation group.

3 讨论

睡眠剥夺是本身由于外在或内在因素导致睡眠无法满足，短暂时间的睡眠剥夺被认为与疾病、创伤等因素相关，是一种应激反应，可造成机体正常生理功能的紊乱，降低机体免疫功能[5]。睡眠剥夺是造成焦虑的原因之一，特别在女性中更为严重[6]；会降低人的注意力，且随着任务时间的延长，关注度会持续变差[7]。 本研究发现与对照组相比，1 d、7 d REM睡眠剥夺组错误反应次数增加；与1 d REM睡眠剥夺组相比，7 d REM睡眠剥夺组错误反应次数增加。REM睡眠剥夺增加错误反应次数，使出错概率增加，从而加重疾病进程。

免疫因子TNF-α、IL-1、IL-6在研究中应用广泛。其中TNF-α作为一种细胞因子，由单核细胞或活化的吞噬细胞产生，具有免疫功能；在重度溃疡性结肠炎大鼠模型中，抗TNF-α后可调节肠道菌群和免疫系统从而缓解疾病[8]。IL-1来源广泛，是急性期免疫反应的主要调节因子，主要发生部位在神经系统和脊髓中；当IL-1浓度较低时，主要发挥免疫功能，可促进T细胞、B细胞的生长及产生免疫球蛋白[9]。IL-6作为一种调控因子，可促进B细胞分化和分泌抗体，同时对机体感染和损伤刺激起调节作用；IL-6可影响肝癌患者病毒感染后免疫功能从而影响疾病[10]。本研究发现1 d REM睡眠剥夺组海马组织、前额叶皮质区细胞均出现神经元丢失、肿胀、变性和死亡，以及炎症细胞浸润和神经胶质细胞增殖现象。7 d REM睡眠剥夺组海马组织、前额叶皮质区细胞均出现大量神经元丢失，肿胀，变性和死亡，以及炎症细胞浸润和神经胶质细胞增殖现象。睡眠剥夺会引发脑部海马、前额叶皮质区组织细胞出现炎症现象，会使各细胞变形、肿胀，严重使致死；且随着睡眠剥夺时间的延长，各种不良症状加重。与对照组相比，1 d、7 d REM睡眠剥夺组血清中TNF-α、IL-1、IL-6升高；与1 d REM睡眠剥夺组相比，7 d REM睡眠剥夺组血清中TNF-α、IL-1、IL-6升高。睡眠剥夺不仅影响脑部神经细胞，还导致全身免疫因子失衡，导致机体指标紊乱影响健康，且随着时间的增加各项指标变化严重，但具体机制尚不明确。

miRNA参与固有免疫炎症反应的研究是一个热点问题，miR-155可调节CD4+Treg细胞的表达从而影响冠状动脉斑块稳定性[11]；miR-155纳米颗粒在鼠内巨噬细胞的细胞摄取方面表现出优异的能力，miR-155逃逸进入细胞质和免疫抑制性肿瘤微环境中，可显著抑制髓样抑制细胞的形成并刺激T淋巴细胞在体外分泌更多的干扰素-γ细胞因子，提高CD4+和CD8+T细胞的浸润和活化，从而调节肿瘤微环境[12]。在类风湿性关节炎等慢性炎症疾病中，miR-155抑制剂可降低TNF-α诱导的成纤维样滑膜细胞增殖，并减弱TNF-α诱导的IL-6和IL-1β产生从而抑制疾病的进展[13]。miR-155调节免疫因子影响从而免疫功能，但具体通路有待验证。本研究发现前额叶皮质区组织中miR-155差异无统计学意义。与对照组相比，1 d、7 d REM睡眠剥夺组海马组织中miR-155升高；与1 d REM睡眠剥夺组相比，7 d REM睡眠剥夺组海马组织中miR-155升高。受部位影响，miR-155在睡眠剥夺中可能在海马组织中发挥作用；miR-155表达升高使机体免疫功能降低，随着免疫剥夺时间的延长，miR-155作用越强免疫功能低下越严重加重机体损伤。

SOCS1蛋白具有调节细胞因子、阻断增强细胞因子作用，与自身免疫、超敏反应相关；是负调控因子，可抑制多种信号的传导，可抑制NF-κB[14，15]。NF-κB可促进TNF-α、IL-1β及IFN-γ等的生成，这些因子又可反过来激活NF-κB信号通路，反复促进炎症反应，进一步加重肝细胞损伤，使免疫性肝损伤加重[16，17]。SOCS1/NF-κB通路中激活SOCS1的表达可抑制NF-κB磷酸化从而抑制巨噬细胞M1极化葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎[18]。miR-155表达升高可抑制SOCS1的表达从而激活NF-κB[19]。金雀异黄素通过miR-155/SOCS1介导的抑制脐静脉内皮细胞中NF-κB信号通路的作用来保护ox-LDL诱导的炎症[20]。miR-155、SOCS1、NF-κB各因子均在免疫功能上发挥作用，通路可直接调控免疫相关因子。与对照组相比，1、7 d REM睡眠剥夺组海马组织、前额叶皮质区组织中SOCS1水平降低；7 d REM睡眠剥夺组海马组织、前额叶皮质区组织中，1 d REM睡眠剥夺组前额叶皮质区组织中NF-κB水平升高。与1 d REM睡眠剥夺组相比，7 d REM睡眠剥夺组海马组织、前额叶皮质区组织中SOCS1水平降低；NF-κB水平升高。miR-155表达升高可抑制SOCS1的表达，激活NF-κB水平使免疫因子水平升高，降低免疫功能；且随着时间的延长，该影响作用越明显，从而加重睡眠剥夺。

综上所述，miR-155表达升高可抑制SOCS1表达，从而激活NF-κB，使免疫因子水平升高，降低睡眠剥夺后免疫功能，使机体免疫失衡。但免疫受多条通路的影响，其中miR-155/SOCS1/NF-κB只是其中的一条通路，其他通路也可能对该通路造成影响，分析通路间的相互作用对免疫的影响可能使文章说服力更强。因此，下一步就miR-155/SOCS1/NF-κB通路的紧密通路做进一步研究。