益生菌对EAE小鼠肠道菌群及TLR4/NF-κB信号通路的影响①

王志豪 龙 婷 陈 秀 李作孝

(西南医科大学附属医院神经内科，泸州 646000)

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是中枢神经系统自身免疫性疾病，其病因和发病机制尚未明确，可能与病毒感染、遗传因素、环境因素、自身免疫因素等有关，而肠道微生态改变可能就是其中一个重要的环境因素。肠道菌群作为肠道微生态的核心组成部分，可通过微生物-肠-脑轴调控中枢神经系统的发育与功能，同时在疾病进展中发挥致病和保护作用。肠道菌群参与机体多种生理生化过程，如免疫、营养、神经内分泌等。菌群的更替、紊乱与肠道慢性炎症性疾病、MS、帕金森病、抑郁症、焦虑症、脑血管疾病的发生发展密切相关[1，2]。Jangi等[3]研究发现MS患者肠道微生物种属组成、菌群生物多样性均与健康人存在差异。Cekanaviciute等[4]也发现用MS衍生的粪便定植的无菌小鼠具有更严重的实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)症状。双歧杆菌乳杆菌三联活菌片作为益生菌代表，具有调节肠道菌群平衡、维持肠道微生态稳定的作用，能抑制肠道致病菌，改善肠道功能紊乱。研究表明益生菌对帕金森病、阿尔茨海默病、脑血管病等神经系统疾病具有一定治疗作用[5]。EAE模型是目前研究MS最经典的动物模型，因此，本实验旨在研究EAE小鼠肠道菌群的变化，通过益生菌干预改变EAE小鼠肠道菌群，观察其对EAE小鼠的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 30只SPF级C57BL/6雌性小鼠(6～8周龄，18～22 g)购于北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号：[SCXK(京)2016-0002]，饲养于西南医科大学忠山校区SPF级动物房内，自由摄入普通饲料及饮用无菌蒸馏水，饲养室温(24±2)℃，每12 h明暗交替1次，实验过程符合《实验动物饲养和使用条例》。

1.1.2益生菌及主要试剂 双歧杆菌乳杆菌三联活菌片(内蒙古双奇药业公司，批号：S19980004)；MOG35-55多肽(上海吉尔生化有限公司)；完全弗氏佐剂、百日咳毒素、ELISA试剂盒(美国Sigma公司)；卡介苗冻干粉 (上海瑞楚生物科技有限公司)；luxol fast blue(LFB)染液试剂盒、兔抗TLR4、NF-κBp65抗体、山羊抗兔二抗(Aspen公司)；双歧杆菌培养基、乳杆菌选择培养基、肠球菌培养基(北京陆桥技术有限责任公司)；梭菌培养基、拟杆菌培养基(青岛海博生物技术有限公司)；肠杆菌培养基、消化链球菌培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)；真杆菌培养基(卡迈舒上海生物科技有限公司)；酵母菌培养基(北京北纳创联生物技术研究院)；引物设计合成(武汉金开瑞生物工程有限公司)；RT-PCR试剂盒(ELK Biotechnology公司)。

1.2方法

1.2.1EAE模型制备、分组及益生菌干预方法 将30只小鼠随机分为正常对照组、EAE模型组、益生菌组，造模前各组小鼠均禁食、禁饮24 h，将MOG35-55溶于PBS，稀释至3 mg/ml，卡介苗溶于完全弗氏佐剂，浓度为10 g/L。将上述2种液体1∶1 混匀至乳化剂。用1 ml注射器分别在EAE模型组、益生菌组小鼠背部皮下注射诱导乳化剂0.2 ml(脊柱两侧任选4点各0.05 ml)制作EAE模型，正常对照组注射等量生理盐水。在造模当天及2 d后，造模小鼠均腹腔注射0.5 ml百日咳菌稀释液，正常对照组注射等量生理盐水。益生菌组从造模次日开始以0.4 ml/d的益生菌溶液灌胃，正常对照组、EAE模型组每天灌胃给予等量生理盐水，发病高峰期(神经功能评分连续3 d无变化为高峰期)处死EAE模型组、益生菌组小鼠，正常对照组小鼠观察至第28天处死，取粪便、脑组织进行后续实验。

1.2.2小鼠发病情况观察 造模当日起每天早8∶00 观察并记录小鼠体质量变化、毛发光泽情况，并根据Kono5分评分法进行神经功能评分。评分细则如下：0分为不发病；1分为尾巴无力；2分为轻微后肢无力；3分为严重后肢麻痹；4分为四肢麻痹；5分为濒死或死亡。

1.2.3LFB染色 取脑组织侧脑室周围组织常规石蜡切片，片厚6 μm，将石蜡切片脱蜡，放入95%乙醇中醇化5 min，然后放入LFB染液中60℃水浴24 h，醇化、分化、镜检、封片。

1.2.4肠道菌群检测 分别采集3组小鼠发病高峰期的新鲜粪便样本10 g，快速置于粪便厌氧装置，-80℃冻存。检测时取0.5 g粪便标本，用肉汤10倍梯度稀释(1×10-7～1×10-2) 。取20 μl菌液滴种于肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、酵母菌、拟杆菌、双歧杆菌、消化链球菌、乳酸杆菌、真杆菌及梭菌的选择性培养基。前4种为需氧菌，置于37℃普通培养箱培养48 h，其余为厌氧菌，置于厌氧培养箱中培养 72 h。采用日本光冈肠道菌群分析法进行定性定量检测，以API生化鉴定系统的厌氧菌三级鉴定法鉴定菌种，鉴定细菌至属水平，观察结果并计数，以每g湿粪的菌落形成单位(colony forming unit，CFU) 的对数值表示。B/E值为双歧杆菌与大肠杆菌数量的比值，用来反映肠道的功能状况。B/E值>1表示肠道定植抗力正常；B/E值<1表示肠道定植抗力降低，菌群结构发生紊乱。

1.2.5ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α表达 采用ELISA试剂盒检测各指标水平，按说明书进行操作。

1.2.6免疫组织化学法(IHC)检测NF-κBp65核表达 脑组织切片脱蜡至水，置于EDTA缓冲液中微波加热行抗原修复，3%H2O2溶液室温孵育10 min(以清除内源性过氧化物酶活性)，5% BSA封闭 20 min 后滴加稀释的一抗(1∶50)4℃过夜，滴加二抗(1∶1 000)37℃孵育50 min，PBS液漂洗，DAB显色，脱水透明封片。在光镜下放大100倍摄取图像，输入图像分析系Image Pro Plus6.0内对图像进行灰度变换，使染色阳性区域与背景明显分开，自动测量阳性面积、积分光密度，并计算平均光密度值，进行半定量分析处理，取其均值为光密度值，表示NF-κBp65的相对表达量。

1.2.7RT-PCR检测TLR4和NF-κBp65 mRNA表达 采用TRIpure法提取各组小鼠脑组织RNA并行反转录，根据M-MLVReverse Transcriptas试剂盒说明书操作得到cDNA模板，利用QuFast SYBR Green PCR Master Mix荧光染料PCR扩增R-MBP的基因片段。PCR扩增引物序列，TLR4 F：5′-ACACTTTATTCAGAGCCGTTGGT-3′,R:5′-CAGGTCCAAGTTGCCGTTTC-3′,NF-κBp65 F:5′-ACTATGAGGCTGACCTCTGCC-3′,R:5′-TCTGGATTCGCTGGCTA-

ATG-3′,内参M-GAPDH F:5′-TGAAGGGTGGAGCCAAAAG-3′，R:5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。反应程序为：95℃ 30 s，95℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s， 40个循环。反应液为：2×Master Mix 5.0 μl，引物工作液(2.5 μmol/L) 1.0 μl，上、下游引物各1.0 μl，ddH2O 2.0 μl，Rox 1.0 μl。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。

1.2.8Western blot检测TLR4和NF-κBp65蛋白表达 向各组小鼠脑组织加入裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后，除去封闭液，加入用稀释液稀释好的一抗4℃孵育过夜。回收已稀释的一抗，TBST清洗3次，每次5 min，加入二抗稀释液，室温孵育 30 min，TBST在室温下摇床上清洗4次，每次5 min，滴加新鲜配制的ECL 混合溶液到膜的蛋白面，暗室中曝光，根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影，采用AlphaEaseFC软件处理系统分析目标条带的光密度值。

2 结果

2.1各组小鼠一般情况及神经功能缺损评价 正常对照组小鼠均未发病。EAE模型组小鼠造模成功后精神萎靡、毛发光泽度降低、脱毛、食欲下降、体质量减轻，症状逐渐加重，出现尾部下垂、步态不稳、后肢行走无力甚至瘫痪。益生菌组小鼠也表现出与EAE模型组小鼠同样的症状，但较EAE模型组症状轻。益生菌组小鼠发病潜伏期、高峰期较EAE模型组均有延长，神经功能评分较EAE模型组降低(P<0.05)。各组小鼠发病潜伏期、高峰期及高峰期神经功能障碍评分结果，见表1、图1。

图1 神经功能缺损评分变化示意图Fig.1 Schematic diagram of changes in neurological defi-cit scores

表1 两组发病潜伏期、高峰期、高峰期神经功能障碍评分比较Tab.1 Comparison of latent period，peak period and neuro-functional deficiency scores in two groups

2.2各组小鼠脑组织病理变化 正常对照组小鼠脑组织LFB染色髓鞘结构清晰。EAE模型组、益生菌组小鼠均出现不同程度的脱髓鞘，髓鞘结构排列稀疏、紊乱，可见不同程度的低染区域及空泡状结构，益生菌组上述变化较EAE模型组轻。见图2。

图2 各组小鼠脑组织LFB染色情况(×200)Fig.2 Demyelization in brain tissues of mice in different groups by LFB staining(×200)Note:A.Normal control group;B.EAE model group;C.Probiotic group.

2.3各组小鼠肠道菌群变化 在培养的10种肠道主要细菌中，EAE模型组与正常对照组相比，拟杆菌数量减少(P<0.05)。益生菌组与EAE模型组相比，双歧杆菌、乳杆菌数量增加(P<0.05)。益生菌组与EAE模型组相比，B/E值上升(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠肠道菌群值和B/E值比较湿粪)Tab.2 Comparison of intestinal flora value and B/E value of mice in each CFU/g wet feces)

2.4各组小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α表达情况 EAE模型组与正常对照组相比，IL-1β、IL-6、TNF-α表达上升(P<0.05)，益生菌组和EAE模型组相比，IL-1β、IL-6、TNF-α表达降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较Tab.3 Comparison of IL-1β，IL-6，TNF-α contents in brain tissue of each group of

2.5各组小鼠NF-κBp65核表达情况 EAE模型组(69.09±3.23)和正常对照组(20.41±1.47)相比，NF-κBp65核表达上升(P<0.05)；益生菌组(52.69±1.96)与EAE模型组相比，NF-κBp65核表达降低(P<0.01)。见图3。

图3 各组小鼠脑组织NF-κBp65细胞核表达的IHC检测结果(×200)Fig.3 IHC results of nuclear expression of NF-κBp65 cells in brain tissue of mice in each group(×200)Note:A.Normal control group;B.EAE model group;C.Probiotic group.

2.6各组小鼠TLR4、NF-κBp65 mRNA表达情况 EAE模型组与正常对照组相比，TLR4和NF-κBp65 mRNA表达上升(P<0.05)；益生菌组与EAE模型组相比，TLR4和NF-κBp65 mRNA表达降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组小鼠TLR4和NF-κBp65 mRNA表达Tab.4 Expressions of TLR4 and NF-κBp65 mRNA in each groups of

2.7各组小鼠TLR4、NF-κBp65蛋白表达情况 EAE模型组与正常对照组相比，TLR4和NF-κBp65蛋白表达上升(P<0.05)；益生菌组与EAE模型组相比，TLR4和NF-κBp65蛋白表达降低(P<0.05)。见表5、图4。

表5 各组小鼠TLR4和NF-κBp65蛋白表达Tab.5 Expressions of TLR4 and NF-κBp65 proteins in each group of

图4 Western blot检测各组小鼠脑组织蛋白表达Fig.4 Western blot analysis of brain tissue protein expre-ssions in each group of miceNote:1.Normal control group;2.EAE model group;3.Probiotic group.

3 讨论

肠道微生态是人体最大且最复杂的微生态系统，其核心部分是肠道菌群，在漫长的协同进化过程中，肠道菌群与宿主形成了紧密的共生关系。肠道菌群与中枢神经系统密切相关，并对肠道的功能调节和稳态维持起重要作用。鉴于肠道微生物群和宿主的复杂关系，近年来提出了一种新的理念，即微生物-脑-肠轴，由中枢神经系统、自主神经和肠神经系统共同形成神经-内分泌网络，可局部调控、整合和处理信息[6]。越来越多的研究证明肠道微生物群和宿主的共生相互作用能诱导自身免疫性疾病的发生发展，如MS和EAE[7]。MS是一种自身免疫性疾病，其自身免疫起源尚不清楚，诱发炎症因素在中枢神经系统或外周亦不明确，Oksenberg等[8]研究表明，在单卵双胞胎中，MS占25%，遗传和环境因素都可能导致该病发生，而肠道菌群就是其中1个不可忽略的环境因素。

本研究表明，EAE模型组的拟杆菌含量明显低于正常对照组，这与Jangi等[3]采用16S基因测序法研究MS患者肠道菌群变化结果基本一致。拟杆菌正常寄居于人和动物的肠道、上呼吸道和生殖道，长期应用广谱抗生素、激素、免疫抑制剂等均可导致肠道菌群失调或免疫功能紊乱，从而引发内源性感染[9]。EAE模型组B/E<1表明EAE小鼠肠道菌群平衡失调，肠道定植能力下降。肠道菌群紊乱可破坏肠道屏障，增加其通透性，使各种细菌及其代谢产物易于透过肠道屏障作用于全身，参与多种疾病的发病及病理生理过程；而肠道定植能力是机体免疫的重要组成部分，其水平下降可增加肠道感染风险。Riccio等[10]研究表明，饮食可以影响复发-缓解型和原发性MS的严重程度，高盐、动物脂肪、红肉、碳水化合物可能会加重症状，蔬菜、水果、益生元和益生菌可通过保持健康的肠道菌群以减轻症状。由此说明通过改变共生肠道菌群的组成、数量、结构可能影响MS的病程[11]。双歧杆菌、乳杆菌是肠道微生物中最重要的益生菌，对维持肠道菌群平衡发挥重要作用，双歧杆菌是一种生理性有益菌，具有抗肿瘤、增强免疫、改善胃肠道功能等多种重要的生理功能[12]。其可在肠黏膜表面形成生物学屏障、机械屏障，可降低肠道pH值，此外还可减少肠道内有害物质如过氧化氢、羟基苯等的产生[13，14]。乳杆菌可降低肠道pH值，为有益菌群提供适宜的生存环境，并能抑制潜在致病菌的生长，有助于维持肠道内环境稳定；同时能恢复细胞因子，维持细胞因子平衡[15]；此外，乳杆菌还可减少肠道中炎症介质的释放，调节肠道免疫功能，进而减轻肠道炎症反应[16]。提示益生菌可抑制肠道内源性及外源性潜在致病菌对肠上皮细胞的黏附和定植；同时，益生菌还能通过争夺营养、调节肠道pH值、产生具有广谱抗菌作用的物质等多种生物拮抗功能，对肠道内致病菌起抑菌或杀菌作用，对维持肠道菌群的稳态、调节肠道功能至关重要[17]。本研究结果显示，益生菌组小鼠肠道中双歧杆菌、乳杆菌、B/E值明显高于EAE模型组，表明益生菌能有效改善EAE小鼠肠道微生态环境，提高肠道定植抗力。

Varga等[18]和Garcia等[19]研究表明肠道中有害菌群产生的毒素能被肠道吸收进入血流，引起MS样症状，这些毒素可与受体结合后存在于大脑的血管系统和有髓鞘、无髓鞘的脑组织区域[20]。过量的肠道细菌及其产物可通过肠道黏膜屏障进入肠系膜淋巴结、血液或其他肠外脏器，并能透过血脑屏障进入中枢神经系统，通过一系列的炎症反应诱导神经细胞凋亡与氧化损伤，最终导致脑损伤[21-23]。TLR4/NF-κB信号通路是调节炎症细胞因子产生的关键途径。TLR4是细菌LPS的受体，能将LPS转导途径的信号迅速传至核内，激活位于下游枢纽位置的NF-κB，活化的NF-κB入细胞核促进炎症细胞因子的合成和释放。既往研究发现，TLR4在中枢神经系统的表达水平在EAE的整个疾病进程中始终呈持续升高状态[24]。本研究也显示EAE模型组TLR4和NF-κBp65在mRNA和蛋白水平上表达均显著升高，NF-κBp65核表达增加，NF-κB下游炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量增加，提示TLR4/NF-κB信号通路的激活可能参与EAE的发病过程。抑制TLR4信号转导途径对NF-кB的激活、对疾病的发病、进展均有一定抑制作用[25]。本研究显示，益生菌组小鼠通过益生菌干预调节肠道菌群后，TLR4和NF-κBp65在mRNA和蛋白水平上表达显著下调，NF-κBp65核表达减少，IL-1β、IL-6、TNF-α含量也明显减少，提示益生菌可抑制TLR4/NF-κB信号通路。

益生菌具有调节肠道菌群，维持肠道稳态作用。益生菌组小鼠发病潜伏期、高峰期延长，临床症状轻，神经功能评分降低，脑组织脱髓鞘轻。上述结果均表明，益生菌调节肠道中双歧杆菌、乳杆菌等有益菌群，提高了肠道定植抗力，可发挥治疗EAE作用，对改善EAE的临床症状具有一定的治疗意义。推测其作用途径可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，进一步抑制下游炎症因子释放的级联效应。对于EAE小鼠肠道菌群的变化及其代谢产物如何调控TLR4/NF-κB信号通路，本课题组将于后续实验进一步研究。