鼻渊通窍颗粒通过调节SP-A水平及Th1/Th2/Th17细胞平衡缓解变应性鼻炎的实验研究①

陈敏云 王佳蓉 吴瑞珊

(福建医科大学附属第二医院耳鼻喉科，泉州 362000)

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是鼻黏膜接触吸入性变应原后由IgE介导的以嗜酸性粒细胞为主的鼻黏膜炎症，为Ⅰ型变态反应，在亚洲人群中的患病率高达38%[1]。典型的临床症状为鼻塞、清水样鼻涕、阵发性喷嚏、鼻痒等[2,3]。部分AR患者可合并哮喘、慢性咳嗽等下气道疾病。鼻渊通窍颗粒是临床中常用的鼻部药物，疏风清热，宣肺通窍，常用于急鼻渊(急性鼻窦炎)属外邪犯肺证[4]。目前关于其对AR的作用机制尚不明确，因此本研究旨在探讨鼻渊通窍颗粒缓解AR的作用及相关信号通路，以期为其更科学的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 2～3周龄SPF级SD大鼠45只，体质量(150±20)g，由福建医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(闽)2015-0001，单位使用许可证编号：SYXK(闽)2015-0023。

1.1.2主要试剂 表面活性蛋白(surfactant protein A(SP-A)抗体、TLR4抗体、NF-κB p65抗体购于上海顺博生物工程有限公司；抗原修复试剂盒及ELISA试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司；鼻渊通窍颗粒购于山东新时代药业有限公司(国药准字Z20030071)。

1.2方法

1.2.1模型构建及分组 45只大鼠随机均分为对照组、AR模型组、鼻渊通窍颗粒治疗组，分别采用不同的处理方法。AR模型组：模型构建分为基础致敏阶段及局部激发阶段。基础致敏阶段：将 OVA 0.3 mg、Al(OH)330 mg、生理盐水1 ml混合制成混悬液，腹腔内注射，隔1 d注射1次，共注射7次。局部激发阶段：第一阶段完成后，以2% OVA滴鼻，每侧鼻腔50 μl，1次/d，共进行7次。对照组：正常饲养，以等量生理盐水替代OVA，其余操作同模型组。治疗组：模型构建方法同模型组，同时以鼻渊通窍颗粒溶液滴鼻，每侧鼻腔 50 μl，1次/d，共15次。

1.2.2HE染色 实验结束后处死大鼠并切下头部，取出上颌骨，固定于4%多聚甲醛溶液，将鼻中隔软骨连同其表面黏膜一同取下。浸泡于10%EDTA 脱钙液，连续7 d，每天更换脱钙液。常规石蜡包埋、切片、烤片，冷却后低温冻存。经二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化。苏木素染色30～60 s，冲洗5 min，伊红染色30 s，冲洗5 min；乙醇梯度脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干，光学显微镜下观察。

1.2.3免疫组化染色 颈动脉组织经甲醛固定后，石蜡包埋、切片。对组织切片进行常规脱蜡、水化，H2O2去离子水孵育。高温修复抗原，PBS冲洗，滴加100 μl鼠抗人SP-A单克隆抗体(1∶1 000),4℃冰箱孵育过夜。PBS冲洗3次,每次2 min。滴加二抗，37℃孵育20～30 min。PBS冲洗3次,每次2 min。DAB显色、苏木素复染、脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。以出现棕色颗粒为SP-A阳性标准。

1.2.4Western blot检测 收集各组大鼠鼻黏膜组织，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。混合上样缓冲液，煮沸变性，电泳、转膜、封闭、一抗二抗孵育、ECL法显影定影。Quantity One软件分析条带，以β-actin为内参，检测TLR4、NF-κB p65蛋白表达。

1.2.5ELISA检测 将获取的每组大鼠肺泡灌洗液，使用IgE、ECP、OVA-sIgE、IL-1β、IL-18、IL-17、IFN-γ、TGF-β1 ELISA 试剂盒测定各组细胞因子的浓度,按照说明书操作。 根据标准曲线计算各组细胞因子浓度。

1.2.6流式细胞检测 于大鼠脾脏处剪开小口，用弯头小镊夹出脾脏。放入装满1640培养液的1.5 ml EP管中，置于冰上待用，研磨后得到初步的脾细胞悬液。300 g离心5 min，弃上清，以流式染色缓冲液重悬细胞提纯脾细胞悬液，PBS 清洗2次，将细胞稀释至1×107个/ml，分别取100 μl细胞悬液到对应的培养孔中，加入1 ml刺激液，4 h后，离心7 min，胞外染色、破膜，胞内染色，上机检测。

2 结果

2.1各组大鼠的体质量变化 在实验的第1天、第22天(给药前)，3组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)。36 d给药结束时，模型组大鼠体质量显著低于对照组及治疗组(P<0.05)，但对照组及治疗组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)。表1。

表1 各组大鼠体质量变化Tab.1 Weight changes of rats in each

2.2各组大鼠症状比较 模型组及治疗组大鼠在末次鼻腔刺激后均出现明显的刺激症状，包括打喷嚏、搔鼻、易怒、易激惹等。对照组及模型组大鼠在治疗前后症状评分差异无统计学意义(P>0.05)，而治疗组大鼠症状评分显著降低(P<0.05)。两两比较后发现，模型组大鼠的喷嚏次数及抓鼻次数显著增加，治疗组次之，对照组最少，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠症状比较Tab.2 Comparison of symptoms of rats in each

2.3各组大鼠鼻黏膜组织HE染色 HE染色结果显示，对照组大鼠鼻黏膜上皮及间质结构正常，无明显病变。模型组大鼠部分鼻黏膜上皮脱落，腺体增生，组织水肿，伴有明显嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润。治疗组大鼠的鼻黏膜仍存在较为明显的上皮病变、腺体增生，但与模型组相比，杯状细胞增生及炎症反应均有所减轻(图1)。

图1 各组大鼠鼻黏膜组织HE染色Fig.1 HE staining in nasal mucosa of rats in each group

2.4各组大鼠鼻黏膜SP-A的免疫组化检测 免疫组化结果表明，SP-A主要定位于细胞质。与对照组相比，模型组及治疗组大鼠鼻黏膜中阳性表达率明显升高，染色程度更深。Image J软件分析结果显示，对照组、模型组、治疗组的SP-A平均灰度值分别为80.46±6.74、110.95±8.32、102.47±7.77，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠鼻黏膜组织中SP-A染色(×400)Fig.2 SP-A staining in nasal mucosa of rats in each group(×400)

2.5各组大鼠血清相关指标比较 ELISA结果显示，与模型组相比，对照组大鼠血清IgE、ECP、OVA-sIgE、IL-1β、IL-18、IL-17水平明显升高，IFN-γ、TGF-β1水平降低(P<0.05)。而治疗组与对照组的IL-1β、L-18、IL-17水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清相关指标比较Tab.3 Comparison of serum related indexes of rats in each

2.6各组大鼠脾脏T淋巴细胞亚群比例 与对照组相比，模型组及治疗组大鼠Th1、T bet+Th1细胞亚群比例显著降低(P<0.05)，Th2、Th17细胞亚群比例显著升高(P<0.05)。与模型组相比，治疗组大鼠Th1、T bet+Th1细胞亚群比例明显上升(P<0.05)，Th2、Th17细胞亚群比例下降(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠脾脏T淋巴细胞亚群比例Tab.4 Proportion of T-lymphocyte subsets in spleen of rats in each

2.7各组大鼠鼻黏膜NF-κB p65和TLR4蛋白表达 与对照组相比，模型组大鼠鼻黏膜TLR4、NF-κB p65蛋白表达均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，治疗组大鼠鼻黏膜TLR4、NF-κB p65蛋白表达明显降低(P<0.05)，治疗组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 大鼠鼻黏膜NF-κB p65和TLR4蛋白表达Fig.3 Expressions of NF-κB p65 and TLR4 protein in nasal mucosa of ratsNote:A.Compared with Control group,*.P<0.05;B.Compared with Model group,#.P<0.05.

3 讨论

AR主要包括以下几种症状：①喷嚏：每天数次阵发性发作，每次多于3个，多在晨起、夜晚或接触过敏原后立刻发作[5，6]；②清涕：大量清水样鼻涕，时有不自觉从鼻孔滴下现象[7,8]；③鼻塞：间歇或持续，单侧或双侧，轻重程度不一；④鼻痒：多数患者鼻内发痒，花粉症患者可伴有眼痒、耳痒和咽痒。

鼻渊通窍颗粒是临床中治疗AR的常用药物，其主要成分包括辛夷、苍耳子(炒)、麻黄、白芷、薄荷、藁本、黄芩、连翘、野菊花、天花粉、地黄、丹参、茯苓、甘草等。AR症见前额或颧骨部压痛，鼻塞时作，流涕黏白或黏黄，或头痛，或发热，苔薄黄或白，脉浮等[9]。本研究通过HE染色发现，模型组大鼠部分鼻黏膜上皮脱落，腺体增生，组织水肿，伴明显嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润。治疗组大鼠的鼻黏膜仍存在较为明显的上皮病变、腺体增生，但与模型组相比，杯状细胞增生及炎症反应均有所减轻。提示鼻渊通窍颗粒对AR大鼠的鼻黏膜有明显的保护作用，可有效抑制炎症反应及杯状细胞增生。

肺表面活性物质蛋白包括表面活性蛋白A、B、C、D 4种[10]。其中，SP-A含量最多，约占50%～70%，参与肺宿主防御。近年来，SP-A在肺外系统中作用的研究越来越多，其可有效抑制变应性哮喘病程中的组胺释放和IgE介导的肥大细胞脱颗粒，表现出强大的抵御变应原的能力[11]。本研究通过免疫组化发现，与对照组相比，模型组及治疗组大鼠鼻黏膜中SP-A阳性表达率明显较高，染色程度更深。提示SP-A可能参与AR的炎症反应过程，且其表达随着疾病程度加重而升高。

细胞内细菌、真菌和病毒的感染可诱导初始T向Th1分化[12]。Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13[13]。在体外，Th2细胞分化的关键步骤是在T细胞活化期间存在外源IL-4而不存在IFN-γ。Th17的大部分效应能力来自IL-17和GM-CSF。IL-17与TNF-α一起通过诱导黏附分子、趋化因子、前列腺素E2和基质金属蛋白酶表达促进炎症发生发展[14]。本研究通过流式细胞术发现，与模型组相比，治疗组大鼠Th1、T bet+Th1细胞亚群比例明显上升，Th2、Th17细胞亚群比例下降。提示鼻渊通窍颗粒可有效调节Th1/Th2/Th17细胞平衡，缓解炎症反应。TLR4诱导的NF-κB信号通路激活在自身免疫性疾病、超敏反应等多种疾病中扮演重要角色。在炎症反应中一旦被激活，即可出发级联瀑布式反应，通过与其他炎症因子相互作用，加重炎症反应。本研究通过Western blot发现，与模型组相比，治疗组大鼠鼻黏膜TLR4、NF-κB p65蛋白表达明显下降，与对照组无明显差异。提示鼻渊通窍颗粒可有效抑制TLR4/NF-κB 信号通路的激活，这可能是其发挥临床效应的机制之一。