植物乳杆菌FEED8对小鼠抗氧化作用的研究

闫刘慧，王小鹏，金庭飞，刘作文，刘力

（1.广东益可维健康科技有限公司，广州 510663；2.河南花花牛乳业集团股份有限公司，郑州 450000；3.福成五丰食品股份有限公司，廊坊 065200；4.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，中国农业大学，北京 100083）

氧化损伤因机体参与氧化应激而导致多种慢性系统疾病，也体现了机体衰老发生与发展的基础病理代谢过程[1,2]，这种代谢过程进一步会诱发炎症、癌症、阿尔兹海默症、心脑血管疾病、肺部疾病、肝脏疾病等慢性疾病，也会导致细胞、组织乃至器官不可逆性的衰老[3～7]，导致机体损伤。当机体的活性氧（reactive oxygen species，ROS）与自由基的生成能力超过清除能力时，活性氧与自由基积累会使得机体氧化还原系统的平衡被打破，对机体造成不可逆影响。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化产生的，MDA在细胞内积累会造成一定的氧化损伤，破坏机体细胞内的核酸、蛋白质、脂质等[8,9]。因此，抗氧化系统对于抵抗氧化应激反应、降低氧化损伤、维持氧化还原平衡具有重要作用[10]。抗氧化系统主要包括两种氧化剂——酶类抗氧化剂和非酶类抗氧化剂，测定抗氧化剂的抗氧化水平可通过测定总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）进行[9]。其中，酶类抗氧化剂主要是催化体内氧化酶的毒性产物H2O2的分解[11]，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（CAT）、巯基依赖型抗氧化系统（如：谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px）等[12]；非酶类抗氧化剂主要包括水溶性抗氧化剂（如：维生素C、硫辛酸LA、尿酸UA）和脂溶性抗氧化剂（如：维生素A、维生素E、辅酶Q10、虾青素）[13～15]。目前抗氧化活性评价方法有四类：体外化学方法模拟法（如：清除自由基、抑制脂质过氧化、螯合金属离子等），优点是方便且快速，缺点是外界环境因素干扰较大[16,17]；抗氧化活性细胞模型法（如：人源或动物源细胞系的抗氧化细胞模型），优点是相对精准，缺点是未考虑体内环境的复杂性，因此只能作为体内实验前的预判断[18]；抗氧化活性体内研究法（如：动物氧化模型），优点是能直接且清晰判断抗氧化能力，缺点是耗时长、成本高[19]；抗氧化活性分子生物学研究法，可以深入探究起氧化作用的具体生物活性物质[20]。近几年关于肠道微生态的研究日益增多，益生菌对于机体抗氧化作用也日益突出，其机制主要从三方面考虑：促进ROS清除、提高抗氧化酶活性、保护DNA免受氧化损伤[21～24]。本试验通过抗氧化活性体内研究法，建立小鼠氧化损伤模型，探究一株植物乳杆菌抗氧化作用的效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验菌株：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarumFEED8，保藏编号为CGMCC No.15029 )，分离自广西巴马长寿老人肠道；实验动物：KM雄性小鼠，SPF级，2月龄，18～22g（广东省实验动物中心）；无乳杆菌小鼠饲料（上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲喂前经辐射灭菌）；D-半乳糖（中国医药集团上海化学试剂公司）；GSH-Px 试剂盒、SOD试剂盒、T-AOC试剂盒、MDA试剂盒，蛋白定量测试盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 仪器与设备

高压灭菌锅（型号GI54DWS，zealway公司）；多功能生化培养箱（型号ZSD-1160，TOKYO RIKAKIKAI CO.LTD）；电热恒温鼓风干燥箱（型号DHG-9076A，上海精宏实验设备有限公司）；低温高速离心机（型号3K30，德国Satorious公司）；紫外-可见分光光度计（型号UV-2800，尤尼柯（上海）仪器有限公司）；匀浆器（德国普鲁克公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 植物乳杆菌活菌体菌悬液的制备

将植物乳杆菌按照107CFU/mL的接种量分别接种于500mL的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养18h，4 500g离心15min收集菌体，菌体沉淀重悬于质量分数10%（w/v）的脱脂乳中，分别配制成2×106CFU/mL的低剂量菌悬液、2×108CFU/mL的中剂量菌悬液、2×1010CFU/mL的高剂量菌悬液。

D-半乳糖溶液：D-半乳糖以灭菌生理盐水配制成60mg/mL溶液，使用前用0.22微孔滤膜过滤除菌。

1.3.2 试验分组

50只小鼠适应一周后，随机分组，每组10只。分组编号、组别、处理方式见表1。期间每3d称重1次，调整灌胃量，连续灌服45d，灌胃量为0.1mL/kg/d。试验期间小鼠自由饮食，12h灯照/黑暗循环。

表1 动物实验分组情况（n=10）

1.3.3 检测指标处理

取上述步骤中连续给予样品45d的实验小鼠，于末次灌胃后称重，并禁食12h，眼球取血并用颈椎脱臼法处死小鼠。肝素钠抗凝管收集血液，3 000g离心10min，上清液0℃低温保藏备用。解剖小鼠，取出脑和肝脏，分别称取0.1～0.2g脑和肝脏组织，加入9倍体积的生理盐水，于匀浆器中制成10%的组织匀浆液，3 000g离心10min，分别取上清液0℃低温保藏备用。通过生化试剂盒分别测GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量和蛋白含量。各测试方法按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学分析

所有数据均用统计软件SPSS22.0进行单因素方差分析，应用Duncans法进行多重比较，通过t检验进行显著性分析，显著性水平均设定为P〈0.05。各项指标结果以“平均值±标准差”(mean±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 试验前后各组小鼠体重变化

试验前后对各组小鼠进行体重测定，结果如图1所示。各组小鼠体重均有所增加。与C2组相比，C1组小鼠增重明显放缓，说明造模成功，造模对小鼠生长有不利影响；与C1组相比，L、M、H组小鼠体重均增加，且M、H组增重较C1组有显著性，说明植物乳杆菌FEED8中高剂量对小鼠生长有显著促进作用；L、M、H组比较，小鼠增重随FEED8浓度增加而增大，说明该菌株在实验浓度范围内小鼠增重与浓度呈正相关。

图1 试验前后各组别小鼠体重变化对比

2.2 植物乳杆菌FEED8对小鼠血清指标的影响

植物乳杆菌FEED8对小鼠血清GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量的影响如图2所示。与C2相比，C1小鼠血清中的GSH-Px活力、SOD的活力、T-AOC含量显著降低，而MDA含量显著升高，说明衰老小鼠造模成功。与C1相比，L、M、H小鼠血清GSH-Px活力、SOD活力，T-AOC含量升高，MDA含量降低，除SOD活力外，M、H组差异显著，说明植物乳杆菌FEED8对小鼠血清具有抗氧化效果，且在实验浓度范围内抗氧化效果随浓度升高而增强。

图2 不同组别小鼠血清抗氧化指标对比

2.3 植物乳杆菌FEED8对小鼠脑指标的影响

植物乳杆菌FEED8对小鼠脑GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量的影响如图3所示。与C2组相比，C1组小鼠脑中的GSH-Px和SOD活力、T-AOC含量均显著降低，而MDA含量显著升高，说明衰老小鼠造模成功。与C1相比，M、H组小鼠脑GSH-Px活力、SOD活力显著提升，L、M、H组小鼠脑T-AOC含量均显著提升，且M、H组小鼠脑MDA含量显著降低，说明植物乳杆菌FEED8对小鼠脑具有抗氧化效果，且在实验浓度范围内抗氧化效果随浓度升高而增强。

图3 不同组别小鼠脑抗氧化指标对比

2.4 植物乳杆菌FEED8对小鼠肝脏指标的影响

植物乳杆菌FEED8对小鼠肝脏GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量的影响如图4所示。与C2组相比，C1组小鼠肝脏中的GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量均显著降低，而MDA含量显著升高，说明衰老小鼠造模成功。与C1组相比，M、H组小鼠肝脏GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量显著提高，且H组MDA含量明显降低，说明植物乳杆菌FEED8对小鼠肝脏具有抗氧化效果，且在实验浓度范围内抗氧化效果随浓度升高而增强。

图4 不同组别小鼠肝脏抗氧化指标对比

3 结论

植物乳杆菌FEED8对D-半乳糖致衰小鼠抗氧化系统的试验表明，与模型组相比，灌胃该菌组小鼠血清、脑、肝脏中SOD活性、GSH-Px活性和T-AOC含量均有升高，MDA含量均有降低，且FEED8中高剂量组数据与模型组相比大多差异显著，三个组织试验结果一致，说明植物乳杆菌FEED8具有抗氧化能力，且随浓度增加抗氧化能力增强。植物乳杆菌FEED8的抗氧化作用，可能与肠道菌群通过参与氧化应激、炎性反应、免疫反应、代谢作用等多种途径[25]影响机体对氧化损伤和组织修复能力有关，其机理仍需进一步探究。