视网膜母细胞瘤的细胞起源研究进展

石寒菡，王少云，贾仁兵

上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科，上海市眼眶病眼肿瘤重点实验室，上海 200011

视网膜母细胞瘤是儿童最常见的眼内恶性肿瘤，好发于3 岁以下儿童，平均发病年龄仅18 个月[1]。视网膜母细胞瘤年发病率为1:14 000 ～1:20 000，每年新发患者约9 000 例，占儿童恶性肿瘤的3%～4%；以我国和印度发病率最高，非洲、南美洲和亚洲的其他地区也较为常见[2-3]。 鉴于不同地区肿瘤患者的异质性，我国研究人员建立了一株汉族人视网膜细胞瘤细胞系[4]，以更好地研究我国视网膜母细胞瘤的发病机制。此外，各地患者的死亡率因医疗条件差异也有所不同：欧美等发达地区视网膜母细胞瘤患者死亡率仅为5%～11%，发病率较高的亚太地区患者死亡率约为30%，医疗条件相对落后的非洲国家患者死亡率则高达73%[5-7]。我国视网膜母细胞瘤患者总摘眼率为50.65%，死亡率为18.64%[8]。40%视网膜母细胞瘤患者为遗传型发病，大部分表现为双眼病变，少数为单眼病变，极少数表现为包括颅内肿瘤在内的3 侧肿瘤；余下60%非遗传型患者均表现为单眼病变[7,9]。视网膜母细胞瘤的临床表现为白瞳症、斜视、眼睑红肿、疼痛、青光眼等，眼底表现为单个或多个灰白色隆起病灶，表面视网膜血管扩张、出血等[10]。全身化学治疗（简称化疗，如静脉化疗等）、局部治疗（如激光治疗、冷冻治疗、玻璃体腔化疗、动脉介入化疗等）、手术治疗（如玻璃体腔切除、眼球摘除、眶内容物剜除等）和放射治疗等均可应用于视网膜母细胞瘤的治疗[11]。

随着视网膜母细胞瘤研究的逐渐深入，细胞起源，即肿瘤细胞由何种细胞演化而来，成为视网膜母细胞瘤研究的重要问题。目前研究人员主要提出了视网膜前体细胞起源、视锥感光细胞起源和水平细胞或Müller 胶质细胞起源3 种视网膜母细胞瘤细胞起源学说，但学界对视网膜母细胞瘤的细胞起源尚无明确定论，因此对视网膜母细胞瘤起源细胞的研究进展进行归纳总结尤为重要。

1 视网膜的发育过程

人类神经视网膜由视网膜多能干/祖细胞分化而成，而视网膜多能干/祖细胞主要分化发育成7 种细胞，分别是视锥感光细胞、视杆感光细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、神经节细胞和Müller 胶质细胞[12-13]。视网膜前体细胞是从视网膜多能干/祖细胞到视网膜细胞的过渡阶段。研究表明，视网膜前体细胞可以通过单向分化产生成熟视网膜组织中的不同细胞类型，但是在视网膜发育的不同阶段，其分化产生的细胞也不尽相同。视网膜发育早期，视网膜前体细胞主要分化产生Müller 胶质细胞和视锥细胞；而视网膜发育晚期，视网膜前体细胞一般会分化产生Müller 胶质细胞和双极细胞[14-15]。除此之外，细胞外环境也会影响分化方向，例如睫状神经营养因子可以促进大鼠视网膜前体细胞分化产生双极细胞；而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27kip1 和p57kip2 在视网膜前体细胞中呈现差异性表达，调节视网膜前体细胞的增殖分化功能[16-18]。视网膜发育过程研究的成果，为探索视网膜母细胞瘤细胞起源奠定了理论基础。

2 视网膜母细胞瘤的细胞学起源

2.1 视网膜前体细胞起源学说

一种观点认为，视网膜前体细胞是视网膜母细胞瘤的起源细胞[19]；其位于视网膜外核层，具有多种视网膜细胞分化潜能[20]。与之对应，视网膜母细胞瘤也具有视锥和视杆感光细胞、水平细胞和无长突细胞等多种细胞的生物学特征，并在超微结构上与视网膜前体细胞相似[21]。从癌基因的角度来看，Lim1（Lim class homeobox gene Lim1）是一种潜在的癌基因，且Lim1 在水平细胞中表达上调而在视锥和视杆感光细胞中表达下调；这一研究结果提示Lim1在水平细胞和感光细胞的共同直接祖细胞即视网膜前体细胞中表达[22-23]。此外，研究[24]表明视网膜干细胞、增殖前体细胞、新生有丝分裂后细胞和重新进入细胞周期的分化细胞均可产生视网膜母细胞瘤，肿瘤起源的异质性提示视网膜母细胞瘤可能来源于上述细胞的共同祖细胞，即视网膜前体细胞，这一研究结果再次支持了视网膜前体细胞起源学说。动物实验研究[25]也显示，视网膜母细胞瘤不是来源于分化成熟细胞，因为在有丝分裂后的细胞或分化的小鼠视网膜细胞的基础上，难以建立视网膜母细胞瘤模型。研究[26-27]发现，抑癌基因RB1（retinoblastoma gene 1）的突变和原癌基因MYCN（MYCN proto-oncogene）的扩增是视网膜母细胞瘤常见的基因突变类型，而且两者有很强的协同作用。然而，在成年的3 周龄小鼠中，当Mycn在Rb1 双等位基因失活的视网膜中过度表达时，小鼠几乎不会出现视网膜母细胞瘤[28]；这一现象也说明了视网膜母细胞瘤并非起源于分化成熟的细胞，同时为视网膜前体细胞起源学说提供了依据。

2.2 视锥感光细胞起源学说

20 世纪80 年代，视网膜母细胞瘤起源于视锥感光细胞和视杆感光细胞2 种学派各执一词，然而后续研究更加倾向于视锥感光细胞起源学说[29]。研究[30]发现，在视网膜母细胞瘤中存在视锥感光细胞特异性标志物，包括视黄酸相关受体γ、视锥细胞特异性甲状腺激素受体β、同源域蛋白（cone-rod homeobox，CRX）和2 种视锥蛋白；该研究突破性地提出了视锥感光细胞是该肿瘤起源细胞的观点。此外，成熟视网膜的特异性标志物也提示了视网膜母细胞瘤的起源细胞。研究[31]表明，视网膜的特异性标志物CRX 和正小齿同源物2（orthodenticle homolog 2，OTX2）在视网膜母细胞瘤组织和细胞系中广泛表达，然而视网膜正常生理研究表明CRX 和OTX2 均在视锥感光细胞中特异性表达，这一研究结果再次支持了视网膜母细胞瘤的视锥感光细胞学说。

然而有研究发现，视网膜母细胞瘤存在异质性，不同患者的肿瘤或者同一患者的不同肿瘤，细胞起源不尽相同。低分化视网膜母细胞瘤患者肿瘤组织表达视网膜前体细胞基因，支持视网膜前体细胞起源学说；而高分化视网膜母细胞瘤患者肿瘤组织病理学表现呈特征性玫瑰花结或花斑，同时表达视锥感光细胞相关基因，支持视锥感光细胞起源学说[32-33]。

此外，视锥感光细胞起源学说也存在矛盾之处：视锥感光细胞在视网膜中心凹区富集，如果该细胞是肿瘤起源细胞，那么肿瘤理应多存在于中心凹区，但85%的肿瘤出现在视网膜后极而不是中心凹区[34]。因此视锥感光细胞起源学说亟待后续研究解释视网膜母细胞瘤的疾病临床特征。

2.3 水平细胞或Müller 胶质细胞起源学说

为了更加深入地研究视网膜母细胞瘤这一儿童时期最常见的眼内恶性肿瘤，研究人员构建了多种视网膜母细胞瘤动物模型。然而研究[35]发现，小鼠和人类视网膜母细胞瘤的细胞学起源不同。视锥感光细胞无法在Rb1 双等位基因失活的小鼠中正常增殖，即便补充人类视锥感光细胞特异性癌蛋白后该细胞依旧无法正常增殖；这一研究说明了小鼠和人类视网膜母细胞瘤细胞学起源的异质性。此外，小鼠肿瘤模型显著表达视网膜神经元特异性蛋白，而人类视网膜母细胞瘤主要表达的是视锥感光蛋白，小鼠肿瘤模型缺乏人类视网膜母细胞瘤特征[36-38]。研究[39]发现，小鼠视网膜母细胞瘤组织特异性表达神经胶质细胞标志物视黄醛结合蛋白（cellular rentinaldehyde binding protein，CRALBP），故小鼠视网膜母细胞瘤模型的肿瘤细胞更可能起源于水平细胞或Müller 胶质细胞。可见，细胞、物种以及发育阶段的特异性均可影响RB1/Rb1 双等位基因失活的结果，这也再一次证明了识别视网膜母细胞瘤起源细胞的重要性。

3 视网膜母细胞瘤的遗传学和表观遗传学特征

3.1 视网膜母细胞瘤的遗传学特征

RB1 基因是最早被发现的抑癌基因之一，全长196 000 bp，包括27 个外显子，其编码翻译的蛋白在细胞的生长分化中发挥了重要的作用[40-43]。研究[40,44-45]发现，RB1 双等位基因突变后，原为视网膜核层的前体细胞向肿瘤细胞样分化改变，其增殖、迁移和侵袭能力均显著增高。经典理论认为，13 号常染色体q14 基因组区的RB1 双等位基因失活是引起视网膜母细胞瘤的重要原因[46]。检索视网膜母细胞瘤突变数据库（Retinoblastoma Gene Mutation Database，RBGMdb）发现，视网膜母细胞瘤特异性突变占已发现的3 393 个RB1 基因突变的50%以上，其中最常见的突变类型为片段插入或缺失（占48.2%）[47]。此外，RB1 双等位基因突变还可导致视网膜外其他部位肿瘤，这有助于解释约22%的视网膜母细胞瘤存活者可继发第二肿瘤，发病率较高的第二肿瘤为骨肉瘤（占37.0%）、其他肉瘤（占16.8%）、黑色素瘤（占7.4%）和脑部肿瘤（占4.5%）等[48-50]。除了经典的RB1 双等位基因突变，视网膜母细胞瘤可能还可由其他因素介导[51]，如部分视网膜母细胞瘤患者体内没有RB1 双等位基因突变，但存在MYCN 基因异常激活[52]。

3.2 视网膜母细胞瘤的表观遗传学特征

表观遗传学因素可单独或可与遗传因素相互作用，促进视网膜母细胞瘤发生和发展，包括长链非编码RNA 和miRNA 调控、甲基化异常等。研究发现，12号染色体上13.32 区域的致病长链非编码RNA GAU1（GALNT8 antisense upstream 1）构象由闭合向开放转变时，招募转录延长因子A1（transcription elongation factor A1，TCEA1）形成GAU1-TCEA1 复合物，激活癌基因GALNT8（polypeptide N-acetylgalactosaminyltransfe- rase 8）的表达，促进肿瘤细胞恶性生长[53]；位于6 号染色体的抑癌长链非编码RNA CANT1（calcium activated nucleotidase 1）通过抑制PI3K/AKT 信号通路抑制视网膜母细胞瘤的恶性生长[54]；长链非编码RNA 转录本RBAT1（retinoblastoma associated transcript-1）在视网膜母细胞瘤中表达显著增高，RBAT1 通过把HNRNPL（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L）蛋白招募到已知癌基因E2F3（E2F transcription factor 3）启动子区域以激活E2F3 转录，从而促进视网膜母细胞瘤的发生和发展[55]。miRNA在视网膜母细胞瘤的发生中也起到了重要作用。研究[56-59]表明，在视网膜母细胞瘤中，Let-7、miR-34a、miR-24、miR-125b 等 抑 癌miRNA 异 常 下 调，而miR-17、miR-181b 等促癌miRNA 却异常上调。此外，通过对4 例视网膜母细胞瘤患者进行全基因组测序发现，SYK（spleen associated tyrosine kinase）基因启动子区去甲基化水平的增高可导致该基因表达的异常上调，这一表观遗传学的改变是导致视网膜母细胞瘤发生的重要因素[60]。

4 总结与展望

不同的起源细胞代表着肿瘤的不同基因表达，决定着细胞形态和临床结局，对疾病的诊断分型以及治疗预后都有着决定性的作用。基于患者肿瘤和动物模型的研究，形成了视网膜母细胞瘤细胞起源的若干学说。这些学说既有支持依据，也存在难以解释的问题。视网膜母细胞瘤的异质性、临床表现多样性、患者预后结局的复杂性，提示该肿瘤很可能不仅仅起源于某个细胞或某个阶段的细胞，而是多种类型细胞在不同时空阶段以及遗传和表观遗传的共同作用下，形成不同表型的肿瘤。未来的研究应着眼于整体和全局的思维，结合转基因动物模型、人源肿瘤异种移植模型（patient-derived tumor xenograft，PDX）、类器官模型，对视网膜母细胞瘤的细胞起源进行深入研究。

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