脂肪来源的间充质干细胞及外囊泡促成骨分化的研究进展

崔雅琦，白玉冰，许怡晨，谭心辰，李梦莹，贾 浩

上海交通大学基础医学院生物化学与分子细胞生物学系，上海市肿瘤微环境与炎症重点实验室，上海 200025

近年来，我国骨质疏松症患病率逐渐攀升。一项最新研究[1]显示，我国骨质疏松症的总患病率为13%，总人数已超过1.78 亿。老年人是骨质疏松症的重点人群，自1982 年起，我国65 岁以上老年人占人口比重不断升高，2019 年我国65 岁以上老年人占人口比重已达到12.6%[2]。预计到2050 年，我国骨质疏松症或骨密度低的患者将达到2.12 亿[1]。骨质疏松症使得骨质脆性增加、易于骨折，导致患者的生活水平急剧下降。利用脂肪来源的间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）诱导成为成骨细胞治疗骨质疏松症是医学研究的新方向[1]。ADMSCs 可以通过旁分泌功能，分泌一些生物活性分子，为组织修复建立良好的微环境，促进新生血管的形成和伤口愈合，并且减少组织的炎症反应。ADMSCs 也可分泌促进血管生成和抗凋亡潜能的生长因子，如转化生长因子（transforming growth factor，TGF）、胰岛素样生长因子（insulin growth factor，IGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）[3]和骨形态发生蛋 白（bone morphogenetic protein，BMP）家 族BMP-2、BMP-7 等[4]。ADMSCs 来源丰富，通过脂肪抽吸术易于获得，无免疫排斥。平均每300 mL 脂肪组织可获得108个 细胞，每克动物脂肪可获得5 000 个成纤维集落形成单位（colony forming unit-fibroblast，CFU-F）[5]。同时，与其他来源的MSCs 相比，脂肪组织来源更为丰富，容易获得。因此，ADMSCs 逐渐成为干细胞研究的热点，应用价值主要表现在组织的修复与重建。本文对ADMSCs 及外囊泡应用于组织工程的状况及未来展望进行综述。

1 ADMSCs 向成骨分化诱导的主要方式

1.1 分泌细胞因子

ADMSCs 可以自分泌或旁分泌多种细胞因子促进其向成骨分化。ADMSCs 分泌成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor 23，FGF23）和 胎 球 蛋 白A（fetuin-A），这两者可以提高细胞内RUNX2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）的表达，促进其向成骨细胞分化[6]。另外，ADMSCs 也可以通过分泌细胞因子BMP2 和TGF-β，激活TGF-β/BMPs 信号通路，诱导其向成骨细胞分化[7]。研究[7]还发现ADMSCs 中存在高表达Toll 样受体1 ～5（Toll-like receptors 1-5，TLRs1-5），应用TLRs 的激动剂可以诱导ADMSCs 分泌高浓度的白细胞介素-6（inteleukin-6，IL-6）。IL-6 单独存在时对成骨分化没有作用，但与可溶性白细胞介素6 受体（soluble interleukin-6 receptor，sIL-6R）结合形成复合体后，两者可共同发挥促进成骨分化的作用。另外，有研究[8]显示，组织微环境中分泌的其他细胞因子，例如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α），在经巨噬细胞集落刺激因 子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF） 与核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）的预处理之后，也可以显著提高ADMSCs 向成骨分化。

1.2 分泌外囊泡

细胞外囊泡是由脂质双分子层包绕形成的球状膜性囊泡，由细胞分泌产生，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体等。目前，关于细胞外囊泡促进成骨分化的研究主要集中在外泌体的作用上[9]。

外泌体直径为30 ～150 nm，由内涵体产生，通过多泡体与质膜融合后释放到细胞外环境中[10-11]，是细胞旁分泌的重要组成部分。人源ADMSCs 的外泌体形态呈杯状，具有CD63 和CD9 等特异性标记[12]。研究[12-13]显示，ADMSCs 的外泌体可以促进骨髓来源的间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs） 向成骨细胞分化。通过释放的外泌体激活了BM-MSCs 中的RUNX2、ALP（alkaline phosphatase）和COL1A1（collagen type 1 α 1）等促成骨相关基因的表达，但是具体机制还有待进一步探讨。进一步研究[14-15]还发现，ADMSCs 的外泌体可以作用于成骨分化后期的BM-MSCs，具体表现为碱性磷酸酶活性大幅升高，有新生钙质生成，RUNX2、ALP和COL1A1 等促成骨相关基因的表达上调。目前还有研究[14]发现，ADMSCs 的外泌体具有阻止MSCs 细胞凋亡、促进MSCs 的增殖、促进血管生成和促进骨形成等作用。

2 ADMSCs 向成骨分化的信号通路调节机制

2.1 TGF-β/BMPs 信号通路

TGF-β/BMPs 信号通路参与绝大多数哺乳动物骨形成。研究[16-17]发现鼠和人的ADMSCs 都可以被骨形态发生蛋白，如BMP-2 和BMP-7，诱导向成骨细胞分化。BMPs 通过激活细胞表面受体复合物BMPR- Ⅰ（bone morphogenetic proteins receptor Ⅰ，BMPR- Ⅰ）、BMPR- Ⅱ 将信号传递到细胞内后，受体活化型Smad（receptorregulated Smad，R-Smad）与共同通路型Smad（common Smad，Co-Smad）形成复合物进入细胞核，与DNA启动子区域相互作用以激活成骨的重要转录因子如RUNX2[18]。BMPs 由多种细胞产生，并累积在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中。在组织修复和重塑过程中，BMPs 从ECM 中释放出来，并与附近的细胞相互作用。研究[19-20]发现，这两类复合体BMP2/BMP7 和BMP2/BMP9 均可以诱导ADMSCs 向成骨分化。Xie 等[18]在大鼠中研究发现，微小RNA-146a（microRNA-146a，miR-146a）是一个ADMSCs 向成骨分化的负调控因子，抑制miR-146a的表达可以显著提高成骨分化的能力。miR-146a 与Smad4的3'非翻译区（3' untranslated region，3'UTR）结合，抑制了Smad4 的表达，降低了BMP2 诱导的ADMSCs 向成骨分化。这也提示我们miR-146a 可以作为一个ADMSCs 向成骨分化的靶标。Lee 等[21]利用小鼠颅脑损伤模型的研究发现，BMP9 处理的ADMSCs 向成骨分化的能力远高于对照组，处理12 周的小鼠颅骨愈合度达到27.39%，远高于对照组的9.89%（P<0.05）。

2.2 Wnt 信号通路

Wnt（wingless/integrated，Wnt）信号通路可以促进ADMSCs 向成骨细胞分化。Wnt 是FZD（frizzled protein family）受体的大家族配体。Wnt 信号通路存在3 种不同的细胞内信号级联：Wnt/β-catenin 途径（经典）、Wnt/Ca2+途径（非经典）和Wnt/planar polarity 途径。研究[22]表明，经典的Wnt/β-catenin 途径和非经典的Wnt/Ca2+都参与ADMSCs 向成骨细胞分化的信号通路。经典途径是Wnt与FZD 或低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related protein5/6，LRP5/6） 结 合 后，使β-catenin 处于未磷酸化的状态，转移到细胞核中调控基因的转录，促进成骨分化。非经典途径是Wnt5 与G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）结合后，激活磷脂酶C（phospholipases C，PLC）的表达，促进Ca2+的释放。释放的Ca2+激活细胞内的RUNX2、ALP和COL1A1 等促成骨相关基因的表达，促进ADMSCs 向成骨细胞分化。研究[23]发现，姜黄素通过抑制miR-126a-3p 的转录，促进ADMSCs 向成骨方向分化。miR-126a-3p 是一个ADMSCs 成骨分化抑制因子，通过与LRP6 的3'UTR 结合，降低LRP6 的表达，阻断Wnt 通路的激活，抑制ADMSCs 向成骨方向分化。

2.3 Notch 信号通路

Notch 信号通路在ADMSCs 的分化及器官形成的过程中发挥作用。在胚胎发育时，Notch 信号通路可以参与小鼠的软骨及骨骼的形成。Liu 等[24]利用小鼠骨关节炎的模型研究发现，注射了BMP9 刺激的ADMSCs 可以促进软骨的再生，达到治疗骨关节炎的目的。主要机制是BMP9通过上调Notch1 和Jagged1 的表达，激活Notch 信号通路，促进ADMSCs 向软骨分化。Notch 信号通路可调节成骨细胞的分化，但是方式相对复杂。Engin 等[25]研究发现，Notch 配体与受体互相作用后，激活细胞内的结构域，与核内转录因子CSL（CBF-1、suppressor of hairless、Lag 的合称）结合，激活HES-1（hairy and enhancer of split-1），HES-1 可以进一步上调RUNX2 的转录，促进成骨分化。Ji 等[26]研究还发现，Notch 信号在成骨的早期与晚期会有不同效果。因为 Notch 信号通路在成骨分化中的作用还不完全清楚，所以Notch 信号通路参与ADMSCs向成骨分化还有待进一步研究。

2.4 Hedgehog 信号通路

Yalom 等[27]研究发现，5 μmol/L 的羟基胆固醇（一种胆固醇的氧化衍生物）可以显著提高人的ADMSCs 向成骨分化。具体表现为碱性磷酸酶活性大幅升高，有新生钙质生成，RUNX2、ALP 和COL1A1 等促成骨相关基因的表达上调。加入环巴胺（Hedgehog 途径抑制剂）可以逆转这个现象，表明Hedgehog 信号通路促进ADMSCs向成骨分化。Shigunov 等[28]利用吗啡胺（Hedgehog 途径激活剂）处理ADMSCs 后，发现Hedgehog 通路的相关蛋白——SHh 蛋白（Sonic hedgehog）、IHh 蛋白（Indian Hedgehog）和DHh 蛋白（Desert Hedghog）等作为细胞外信号与PTCH1（Patched-1）、PTCH2（Patched-2）以及Smo（Smoothened）相应受体结合，激活SUFU（suppressor of Fused）、葡萄糖合成激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）、GSK3β 等胞内小分子信使，促进下游Gli1、Gli2、Gli3 的转录，上调RUNX2、ALP 和COL1A1 等促成骨相关基因的表达；而利用环巴胺处理细胞后，结果正好相反。以上研究均证明了Hedgehog 信号通路参与调控ADMSCs 向成骨细胞分化。

2.5 FGF 信号通路

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）成员可以参与ADMSCs 向不同方向分化的调控[29]。FGF信号通路受多条信号通路调控，比如细胞外信号调节激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、丝裂原活化蛋白激酶（ mitogen-activated protein kinase，MAPK）、应激激活蛋白激酶/C-Jun 氨基末端蛋白激酶（stress-activated protein kinase/Jun N-terminal kinase，SAPK/JNK）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）系统和磷脂酰肌 醇3- 激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） 等，这些通路均与成骨细胞分化相关[30]。研究[31]发现，重组人血小板衍生生长因子BB（recombinant human plateletderived growth factor-BB，rhPDGF-BB）可通过磷酸化ERK 激活MAPK 信号通路，促进ADMSCs 向成骨分化。进一步研究[32]发现，分别利用3 种可以诱导成骨分化的试剂FGFb、BMP2 和NELL1 依次处理ADMSCs 后，10 ng/mL 的FGFb 成骨效果最好，而BMP2 促进成骨分化的效果略差于FGFb。该结果提示FGFb 可以作为ADMSCs成骨分化的首选激活剂。

3 ADMSCs 及外囊泡的临床应用前景

ADMSCs 可以通过分泌细胞因子、细胞外囊泡的方式 激 活TGF-β/BMPs、Wnt、Notch、Hedgehog 和FGF 信号通路，促进MSCs 向成骨细胞分化，因此ADMSCs 及外囊泡可能通过增加骨细胞数量治疗骨质疏松症。本文从成本、安全性和应用前景3 个角度，比较ADMSCs、ADMSCs 外囊泡和BM-MSCs 的异同点，探讨ADMSCs及其外囊泡治疗骨质疏松症的优势和前景。

3.1 ADMSCs 及其外囊泡的提取成本低

ADMSCs 及其外囊泡可以取材于吸脂手术获取的脂肪组织，创伤小，获取方便。BM-MSCs 的分离提纯则以骨髓作为原料，需要进行侵入性手术，难度大，可行性低[14]。研究[33]发现，脂肪提取物中MSCs 的数量约占提取体积的2%，而骨髓中MSCs 的数量仅占0.001%～1.004%。同样体积的脂肪提取物与骨髓相比较，ADMSCs 提取率约是BM-MSCs 的8 倍。比较连续培养5 代的ADMSCs与BM-MSCs 的累计细胞群落增殖（cumulative population doublings，CPD），结果[34]显示每一代ADMSCs 的CPD 均高于BM-MSCs，说明ADMSCs 比BM-MSCs 具有更强的增殖能力。因此，ADMSCs 的获得率远高于BM-MSCs，且增殖能力更强，用于临床治疗的可行性高。

3.2 ADMSCs 及其外囊泡的安全性高

MSCs 可以通过分泌炎症细胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-6）和免疫调节相关细胞因子（如PGR2、TGF-β 和IDO）起到免疫调节的作用[34]。利用ADMSCs或者BM-MSCs 治疗骨质疏松症，免疫排异反应的发生概率可能会显著降低。有临床研究向患者注射自体的含有丰富ADMSCs 的脂肪来源的基质血管成分（adiposederived stromal vascular fraction，ADSVF）[35]或同种异体ADMSCs[36]，患者的心电图、生命体征和体格检查没有变化，不良反应（包括瘘管、轻度至中度的疼痛和注射部位肿胀）也是短暂和可恢复的，证明ADMSCs 及其外囊泡的临床应用具有可行性和安全性。有研究[37-38]发现， BM-MSCs 的系统性输入可能会诱发呼吸衰竭、心力衰竭、弥散性血管内凝血等不良反应，说明直接注射BM-MSCs治疗骨质疏松症具有一定的危险性。但是，无论是活细胞的ADMSCs 还是BM-MSCs 注射入人体后，其分化、增殖和凋亡等情况都不可控[39]。与之相比，采取注射MSCs分泌的外囊泡（如ADMSCs 外囊泡）等非细胞疗法治疗骨质疏松症可能是最安全可控的方法。

3.3 ADMSCs 外囊泡的应用前景好

目前已经有多项研究发现，体内分别移植含有ADMSCs[40-41]、ADMSCs 外囊泡[42]和BM-MSCs[43]的人工支架均可以促进成骨再生。但是，MSCs 在体内扩增时可能发生表型的变化[42]，影响疗效甚至造成不良反应。相比之下，ADMSCs 的外囊泡无细胞分化的风险，更安全可控。另外，ADMSCs 的外囊泡可以直接从人的脂肪组织中提取，避免培养细胞耗费时间。但是ADMSCs 的外囊泡促进成骨分化的具体原因还不清楚，这也是今后研究的重点。现有研究[44]发现，人体不同部位的ADMSCs 增殖及其成骨分化能力具有差异。膝盖和臂部的ADMSCs 增殖能力最强，但是成骨分化能力较弱，需要诱导成骨因子刺激才能向成骨方向分化。臀部和股区的ADMSCs 增殖速度较膝盖和臂部弱，但显示出很强的碱性磷酸酶活性和基质矿化能力，向成骨分化能力最强[44]。但是这种差异的原因还不清楚。未来可以通过优化脂肪提取部位，降低ADMSCs 及其外囊泡的应用成本。

综上所述，利用ADMSCs 外囊泡相较于ADMSCs 与BM-MSCs 具有更好的安全性，经济性和可行性，促进成骨再生的应用前景最好。

4 结语与展望

本文介绍了ADMSCs 向成骨分化诱导的主要方式和ADMSCs 及外囊泡促进成骨分化的相关调控信号通路。通过比较ADMSCs、ADMSCs 外囊泡与BM-MSCs 的提取成本、安全性和应用前景，阐述了ADMSCs 及外囊泡具有转化应用于治疗骨质疏松症的优势。随着我们对外囊泡认识的不断加深，外囊泡逐渐被认为是细胞间通信、疾病诊断和预后的循环生物标志物的重要载体，具有很高的临床应用潜质。我们期待也相信未来会有更多的针对ADMSCs 及其外囊泡促进成骨分化的研究，进而服务于更多的骨质疏松症患者。

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