循环肿瘤细胞在前列腺癌中临床应用的研究进展

孙雪骐，肖英，彭芳，王建，张功亮

（赣州市人民医院病理科，江西 赣州 341000）

在我国，前列腺癌发病率已位居男性恶性肿瘤前列，也是全球与死亡肿瘤相关的主要原因之一[1]。目前是采用前列腺穿刺活检的方法来诊断前列腺癌，然而确诊之后却缺乏简便及准确的指标来监测和指导前列腺癌的预后及个体化治疗[2]。 经直肠或会阴方法进行前列腺活检是一种侵入性创伤的检查，且 偶尔伴有血尿、急性尿潴留、尿路感染和败血症等[3]。 血清前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA） 是辅助临床诊断前列腺癌的常用检查项目[4]，可作为反映治疗和疾病进展有用的生物标志物，但在转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）中已经被证实不能反映临床疗效，也不能反映患者总体生存率[5]。

循环肿瘤细胞 （circulating tumor cell，CTC）是指在肿瘤形成或进展过程中从原发灶或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞。 研究表明CTC 可以为临床提供更全面了解肿瘤生物学和肿瘤传播[7]重要信息。 CTC 检测作为一种新型的非侵入性诊断手段，弥补了传统方法的不足，具有高度敏感性，能及时反应肿瘤的恶性程度和侵犯能力，早于影像学预测复发和转移，相较血清学PSA 检测，其灵敏度及特异性好，可定性、定量检测，并可作为肿瘤细胞分子生物学检测的标本，实现适时、动态、检测，为癌症患者提供实时和连续的“液体活检”检查，实现实时监测癌症进展， 且对有足够多CTC 的患者进行下一步治疗[8]。 在前列腺癌的精准诊疗中引进CTC 这种更具创新有效、 更少侵入性的生物标记物的研究将有助于前列腺癌的诊断、 治疗及预后。 本文将总结分析CTC 在前列腺癌中的技术潜力、应用以及提供用于指导mCRPC 的预后信息。

1 CTC 的概述

1869 年，Ashworth 医生首次提出了 CTC 的概念[9]，指出其能反映原发肿瘤的特性。 随着科学研究的深入，那些被认为具有干细胞样属性且能够启动肿瘤生长的肿瘤细胞在尚未增殖形成可见病灶时，就可以进入血液循环形成CTC[10]。 科研人员发现入血后的肿瘤细胞随着血液快速流动， 大约30秒循环全身，期间与血液中其他血细胞碰撞、受到血管壁的挤压，并且遭受机体免疫系统以及化疗药物的攻击，最终大多数都发生凋亡或坏死。 只有极少数的CTC 克服上述困难，最终存活下来，逃离机体免疫识别或药物治疗的CTC，在体内寻找合适的微环境，最终造成肿瘤的转移或复发[11，12]。因此，CTC的研究可以促进转移肿瘤细胞的优势识别，并为了解这些细胞的功能提供前景及方向。 CTC 的分子分析有助于阐明前列腺癌的侵袭性、适应性、肿瘤传播和转移的机制。

2 CTC 的生物学特性及应用

上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）在中胚层发育、伤口愈合和纤维化中起着至关重要的作用[13]。参与细胞间质转化为以波形蛋白为主，细胞间黏附能力下降，运动能力增加，从而可促使单个肿瘤细胞从肿瘤组织中脱落游走迁移至血管， 认为EMT 在肿瘤转移过程中起着关键作用[14]。 虽然EMT 的概念在肿瘤中仍是一个争论的话题，但肿瘤组织中间充质标志物的表达已被报道是多种肿瘤包括前列腺癌中预后较差的因素[15]。有研究指出了EMT 标志物在CTC 中的表达较高[16]。 另一些研究认为肿瘤细胞从上皮间充质迁移，获得干细胞特性， 具有自我更新分化的能力，EMT细胞同时表达了上皮标志物(如cytokeratins、E-cad henn 等)和间充质标志物（如 N-cadherin， O-cadherin， vimentin， twist， fibronectin， serpin peptidase inhibitor 等），表明上皮细胞可能向间充质表型转变[17]。 这一发现提示CTC 中EMT 相关基因的表达增加与mCRPC 相关，这些与EMT 相关基因特征可能为患者分层和个体化治疗提供新的机会。 大多数CTC 捕获技术都依赖于上皮标记物的表达例如上皮细胞粘附分子 （epithelial cell adhesion molecule，EpCAM），所以EMT 在CTC 的研究中受到了限制[18]， 随着CTC 分离技术的不断发展和CTC 分子定性技术的不断完善，CTC 的功能表征将有助于阐明体内EMT 的过程，明确肿瘤转移机制。

CTC 生物标志物可能反映肿瘤对治疗的耐受性和生存能力， 而检测CTC 分子图谱中蛋白质生物标志物的表达、遗传变异和基因表达，可以利用这些信息监测治疗和检测耐药反应[19]。随着新技术的发展，在不同水平（蛋白质、DNA、RNA 和表观遗传学）的CTC 高通量分子技术得到了快速发展。

3 CTC 的临床应用及疗效评估

除了生物用途外，CTC 分析还具有作为临床生物标志物平台的潜力。 在临床应用上，CTC 可以在前列腺癌的治疗疾病状态中提供预后、预测、药效学或替代用途，从局部疾病转移到mCRPC 和新型治疗的发展。 从CTC 中用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)获取的 PSA 是最早证实mCRPC 患者临床相关预后信息的检测方法之一[20]。 尽管该方法相对容易使用和评估，而且除了血清PSA 蛋白检测之外还提供了独立的预后信息，但该方法并未得到进一步的发展[21]。 高达30%前列腺癌患者会出现PSA 升高，但当前列腺癌Gleason 评分及预后分级分组较高时或患者进入CRPC 阶段，PSA 水平与肿瘤分级不成正比[22]，在患者根治性前列腺术后进行放射治疗期间，这种检测方法有利于评测肿瘤情况和检测早期复发[23]。在早期前列腺癌中可以检测到CTC，并指出在前列腺癌治疗后患者CTC 水平的降低可能是放射治疗反应的结果[24]。CTC 计数是CRPC 患者生存率的一个潜在的独立预后因素，患者开始化疗后，CTC 数量相比于PSA 的水平更先发生变化， 因此癌症患者CT C 的计数在转移性疾病的早期诊断中起关键作用[25]。研究表明CTC 数目与PSA 水平、肿瘤大小和增大的淋巴结之间存在一定相关性[26]，说明CTC 可以联合PSA 作为诊断及检测前列腺癌的标志物。CTC 的计数变化可以作为一个连续变量并对此进行分析，预估患者总体生存率并提供关于疾病进展的独立预后信息，从而监测疾病治疗效果[27]。

4 CTC 的分离富集方法和生物学应用

第一个FDA 认证分析和临床验证CTC 检测平台是CellSearch，CellSearch是一种基于免疫磁性分离原理发展起来的半自动化CTC 检测仪器，捕获表达EpCAM 的细胞，抗EpCAM 抗体与铁磁珠结合， 细胞被分离出来， 然后对细胞角蛋白（cytokeratin，CK） 和 CD45 进 行 染 色 。 使 用CellSearch的初步临床研究[28]评估了964 名患有恶性疾病的患者，其中123 人是转移性前列腺癌。一共有188 名患者提供了样本(每个样本有7.5 ml全血)，其中77 个(41%)的样本有5 个以上数量的CTC。 在344 个健康志愿者或良性疾病样本中，5%的人每7.5 ml 血液中有1 个CTC，在 7.5 ml 血液中没有一个 CTC 超过 2 个。 因此，CellSearch能作为检测前列腺癌患者CTC 的敏感平台。此外，通过重复性试验与中心实验室试验的比较，确定了该试验分析的有效性， 证实转移性肿瘤患者的CTC 计数显著高于良性疾病和健康对照组。 基于这些结果，证明了在转移性前列腺癌中，每7.5 ml 全血中检测到的CTC 数量可以根据环境的不同有很大的差异。 CellSearch检测到的 CTC 可能是mCRPC 患者预后不良的独立预测因子[29]。在一项前瞻性研究中，每管7.5 ml 的血液中检测到的细胞范围从0 到847 不等，CTC 的中位数为 16，且重复性高达（＞ 99%）， 这些细胞的分子分析额外证实了雄激素受体（androgen receptor，AR）扩增或其他前列腺癌特异性生物标志物的表达，证实了它们的恶性来源[30]。

由于在CRPC 中已经证明了由配体介导的AR 信号的持续存在，因此，一种雄激素生物合成抑制剂被用来延长已经接受化疗的CRPC 患者的生命。 运用CTC 这种液体活检方式在衡量AR 信号可能有助于指导转移性前列腺癌的治疗[31]。研究结果表明， 在CRPC 患者的CTC 中监控AR 亚细胞定位可能预示着对紫杉烷化疗的临床反应[32]。此外，在晚期前列腺癌患者的组织样本以及CRPC 患者的CTC 富集的外周血液样本中， 已经发现了代表CRPC 发展的潜在机制的AR 基因的编码突变[33]。

在一项关于CTC 预后影响的前瞻性研究中，研究发现≥5 个CTC 的患者与开始新的细胞毒性治疗前＜5 个CTC 的患者相比，总体生存率更差，≥5 个 CTC 患者的中位总生存期为 11.5 个月， 而＜5个 CTC 患者为 21.7 个月 （HR 3.3，95%可信区间2.2～5.1，P 值＜0.0001）[34]。 因此，≥5 个 CTC 的基线被认为是预后差的预测标志。5 mCRPC 分子生物学标志物在CTC 临床实验的研究

随着我们对mCRPC 的了解和治疗选择的增加，更需要易于检测且能给我们提供有关肿瘤实时信息的生物标志物。 之前在一项评估增殖指数标记物（Ki-67）的初步研究中，从不同前列腺癌患者中分离出的CTC 在Ki-67 阳性中表现出很大的变异性（1～81%），提示 CTC 中 Ki-67 增殖指数的增加与 CRPC 有关[35]。 研究表明，CTC 中微管束的可视化和测量可用于监测多西紫杉醇化疗的药物靶点的参与，这可能有助于预测个体患者治疗的有效性[36]。

CTC 的分子表征可用作药物作用的药效量度或用于患者的各种临床试验设计的选择，CTC 分析可以评估临床试验的早期疗效以及目标参与，可以显著节省药物开发。 例如，在Ⅰ期试验中，mCRPC可以通过促进预测的生物标志物有助于患者选择，应用替代生物标志物开发的新型药物的早期结果来加速试验的进展。同时，获得CTC 分子谱可以为药效方面的研究提供一个实时采样平台，实时监测不同剂量水平下药物对CTC 的影响， 确定药代动力学或药效学的相关性，避免原发或转移前列腺癌活检的重复性。 mCRPC 的CTC 计数现已在 Ⅲ 期随机对照试验中得到前瞻性验证，但在CRPC 的新治疗发展中运用CTC 还存在一些挑战。首先，许多mCRPC 患者缺乏CTC。随着CTC 新技术的发展，更灵敏的CTC 捕获设备可能会解决这个问题。其次，从外周血中检测和捕获的CTC 数量有限， 可能存在不同的CTC 表型，离体培养CTC 用于药物敏感性测试的能力可以克服该限制，但尚未在前列腺癌中得到证实[37，38]。 无论是对前列腺癌个体患者的临床管理，还是对临床试验治疗方法的评估，临床上对高信息性生物标志物的需求仍未得到满足。

小结与展望

对比传统的影像学方法、 血清PSA 检测和骨转移活检都有一定局限性，限制了它们在前列腺癌评估中的应用。目前，CTC 是一种新型生物标志物，无论是在前列腺癌早期、晚期阶段及预后判断治疗效果方面都是很有前景的领域。 CTC 可以来自原发肿瘤本身或转移部位，而且可以通过实时液体活检进行非侵入性测量，它们的分子表征为更好了解肿瘤转移的生物学特性和对已建立的治疗的耐药性提供了独特的潜力。 CTC 研究为细胞、DNA、RNA 或蛋白检测分析方面都提供了卓越的平台，为肿瘤异质性的分析提供了个体化治疗发展的可能。新的检测技术仍需大样本、多中心的研究证实，以达到建立标准化的检测方法和广泛使用，目前缺乏关于临床实践的前瞻性研究， 随着CTC 检测技术的改良进步， 通过 CTC 的液体活检中获得的实时分子信息的合理靶向治疗的使用，验证这些方法与临床的相关性， 将使CTC 更广泛应用于前列腺癌研究并且为患者治疗服务。