LAMP的发展及在口蹄疫诊断中的应用

侯 谦，代军飞，张 杰

(中国农业科学院 兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046)

1 LAMP技术简介

1.1 LAMP背景

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method, LAMP)是一门新兴的基因扩增技术，由日本学者Notomi于2000年在《Nucleic Acids Res》杂志上公开发表。自建立以来，随着该技术的不断发展，已成功地应用于多种病原微生物、胚胎以及食品生物安全等方面的检测。它与经典传统的核酸诊断方法PCR、qPCR相比具有更高或相似的灵敏度，比PCR可高10倍或者更多；反应时间比PCR缩短至30～60 min；无需要特殊仪器；操作简单，核酸(DNA或RNA)检测只需如PCR一样的混合反应体系，完成后可肉眼观察结果[1]。

1.2 LAMP反应原理

LAMP反应是根据靶基因的6个不同区域设计对应的4条引物，分为2条外引物和2条内引物。在LAMP反应时，先由3′内引物的一部分片段和模板链的靶基因区域结合，在BstDNA聚合酶的作用下由3′到5′延伸而逐渐合成内链。然后再由外引物和模板链结合，通过BstDNA聚合酶的链置换功能，沿着外引物扩增出的新链将内引物合成的互补链置换出来。置换出来的互补链成为下一次扩增的模板，重复上面的过程，另一端的内引物也是一部分与互补链相互结合，扩增。再由外引物结合、扩增、置换。这样一个循环结束就可以形成LAMP反应的基础结构——茎环状结构，然后接下来的扩增循环则在基础结构之上由2条内引物参与循环，反应得到的最终产物是长短不一的DNA茎环状片段混合物[2]。

1.3 LAMP产物检测

由上述LAMP反应原理可知，LAMP的最终产物是一系列不同个数的茎环状结构DNA混合物。且LAMP的反应产物也是核酸产物。因此，LAMP扩增产物可以使用电泳和凝胶成像系统来检测。在成像系统中反应产物呈现出典型的梯状条带，可根据电泳条带的有无、形状、明暗来判断反应结果。LAMP扩增核酸时会从dNTPs中析出大量副产物——焦磷酸根离子,它们能与反应液中的二价镁离子结合,生成白色的焦磷酸镁沉淀。沉淀可以通过肉眼直接观察到,以有无乳白色浑浊出现来判断扩增反应是否进行的方法称为浊度观察法。对于浊度观察法来说，有着核酸扩增副产物白色的焦磷酸镁沉淀只有足量产生时才易被肉眼观察到，而沉淀较少时肉眼易产生误差而观察不到沉淀的缺点。由此，实时浊度仪的产生为实时观察反应各时刻的沉淀产生情况提供了条件。此外科研工作者通过尝试添加显色剂的方法来扩大结果肉眼可见的优势——一种最适用于基层临床检测的判断方法。根据LAMP阳性反应前后有显著颜色变化来判断结果，避免了浊度观察法的缺点。一般常见的显色剂有钙黄绿素(Calcein)、根据反应液中pH值变化而变色的羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue，HNB)和结合到DNA双链结构小沟中的SYBR Green 1核酸染料[3-4]。

2 LAMP的发展及应用

LAMP因其简单、便捷等特点而被广泛应用，但单一的目标物检测已经不能满足实际的需求。因此，多重LAMP检测技术也随之发展起来，即在同一反应体系中同时检测多个目标基因，快速提高了目标物的检测效率。根据林文慧等[5]报道了多重LAMP检测技术可以分为狭义多重LAMP和广义多重LAMP。狭义多重LAMP检测技术以多种引物为基础，旨在混合体系中检测出多种病原等目标物。如刘宁伟等针对沙门氏菌的bcfD基因、副溶血弧菌的tlh基因以及单核细胞增生性李斯特菌的iap基因建立了可以同时检测这3种细菌的多重LAMP方法[6]。多重LAMP技术还可以与其他技术连用如实时荧光检测以及ELISA方法。研究人员将与dNTP底物可以特异结合的靶基因探针固定在酶标板上，LAMP反应后的产物就可以进行ELISA步骤，但此方法存在操作较为耗时的缺点。实时荧光的检测通过监测反应过程中的荧光信号强度来判断结果，不仅可以避免LAMP反应开管、产物凝胶电泳等过程，而且可以对目标基因进行定量检测和分析。如田浩等[7]建立了多重荧光LAMP法检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，相对qPCR检测灵敏度103CFU/mL，其检测灵敏度达到了71 CFU/mL。Kouguchi等在LAMP体系中加入带有FAM荧光基团标记的一条引物(另一条则没有)和溴化乙锭嵌合染料，通过带FAM引物荧光信号和溴化乙锭染料之间信号强度的改变，实现了快速且准确实时检测2个大肠杆菌毒素基因的扩增。其成本低于双探针qPCR,但此法在灵敏性和普遍适用性上还需要改进，如在体系优化和结果解析上也有一定的困难[8]。广义多重LAMP技术避开了狭义多重LAMP技术的多组引物之间的相互干扰和竞争，将核酸检测等生化分析的一系列过程缩小到极小的芯片或者毛细管上，以达到减少人工污染等问题，提高检测效率。Fang等[9]在2010年发表论文报道了他们设计了一种多重LAMP检测芯片，能够同时进行8个扩增反应。

LAMP最开始因引物设计长度需要的原因，无法检测小于100 bp的核酸片段。但Marciniak等[10]将LAMP扩增技术、滚环扩增技术成功结合使得核酸短片段31 bp的检测成为可能。另外LAMP引物设计也得到了发展，以前是4条引物对应靶基因的6个不同区域，现在是6条引物对应靶基因的8个不同区域，扩大了引物设计选择区域。且由6条引物的LOOP-LAMP过渡到了STEM-LAMP方法，解决了LOOP-LAMP引物设计的局限性，增加了反应的多重性，以及定量定性的检测[1]。随着分子生物学技术的快速发展，近年来，LAMP方法已被广泛应用于病原微生物的检测，包括细菌、病毒、支原体和寄生虫等；也应用于不同物种性别和胚胎性别以及食品安全、基因芯片等方面的快速检测[11]。LAMP的高敏感性也使得其检测样品多样，2008年，Kelly等在人类免疫缺陷型病毒(HIV)上运用了LAMP检测技术，检测病毒感染者的血浆和血液，而不是核酸提取物。灵敏度可达每管10拷贝，35 min内可完成扩增反应，大大缩短了病毒的检测时间[12]。Park等使用LAMP检测猪圆环病毒3(Porcine circovirus 3, PCV3)的衣壳基因，向反应体系中添加HNB显色剂显示阳性。62 ℃、40 min可完成检测，检测限度为50个拷贝低于常规PCR的拷贝，与PCV3的qPCR反应相当。通过临床样品检测结果表明，PCV3的LAMP检出率高于PCR，与qPCR一致13]。Arfaatabar等[14]在2019年报道将LAMP用于临床支原体的检测，采集患病者的咽拭子样本。在110个样本中，35个样本中检测为阳性。此外，未与其他细菌的基因组DNA出现交叉反应。比培养方法高10个阳性样本的检出，且确定了LAMP测定的检测限为33 fg/μL。与PCR相比，LAMP测定的特异性和灵敏度分别为92.5%、100.0%。

PCR可以鉴定鸟类性别但需要特殊的设施，无法在户外应用。Centeno-Cuadros等研究人员为解决现场和快速了解鸟类个体性别的问题，提出了一种基于重复的性染色体特异基因解旋酶DNA结合蛋白扩增的室外鸟类性别LAMP测定技术。在狮鹫、埃及秃鹰和黑鸢上测试了此方法。成功地跨物种应用于3个不同的猛禽亚科，为其他猛禽亚科的分子性别鉴定提供了一个有应用前景的检测技术[15]。

Mohammad等在文章中提到人类基因中Y染色体的性别决定区基因(sex-determining region of the Y chromosome，SRY)能决定成为男性还是女性，在正常男性甚至性染色体为XX的男性中都有发现，而女性基因中没有。Mohammad等利用LAMP技术鉴定SRY基因，用于妊娠期人类胚胎性别鉴定。收集妊娠8周孕妇15份血浆DNA，LAMP结果表明：男性胚胎7份(46.6%)，女性胚胎8份(53.4%)[16]。

3 口蹄疫的流行现状

口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是一种偶蹄动物易发的急性、热性、高度接触性传染水泡疾病，其易感动物达70多种，偶见于人和其他动物。其临诊特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱，由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)引起[17]。口蹄疫常在春冬季节集中发病，极易造成大面积的流行，虽然病死率低，但是发病率高，一旦暴发此病就会给当地畜牧业以及进出口贸易带来巨大的经济损失。目前，世界动物卫生组织的2/3成员国受到了口蹄疫的感染，且给没有口蹄疫的国家生物安全带来了严重威胁[18]。每年由口蹄疫造成的可见的产品经济损失和在流行区域进行疫苗防控所花费估计为65亿～210亿美元，而暴发口蹄疫的国家则每年损失超过15亿美元[19]。在印度由FMD造成的直接经济损失每年可以达到44.5亿美元。而且由口蹄疫自由国家施加的贸易壁垒造成的经济损失可能更多[20]。

关于口蹄疫最早的相关消息是发生于1514年意大利威尼斯关于牛的描述。到现在已经有500多年的历史了，FMD几乎存在于全世界范围饲养偶蹄动物的一百多个国家。发达国家多半已经消除了FMD，多分布于发展中国家。但是口蹄疫的范围却经常发生变化，2012年SAT-2 FMD在非洲北部和中东地区暴发引起了巨大的损失和国际的危机。2014年O型FMDV在非洲北部的未流行区域的暴发，引发了大家的广泛关注。此外在南非地区，持续的FMD暴发拖慢了要长期建立FMD的控制项目的步伐[21]。而亚洲地区常有外来血清型的出现，比如2015年，一种从未在印度国家出现的血清型为A型的谱系的FMDV在这个国家的展露导致了许多疫病暴发，其传播路径为从中东和土耳其发展而来。以及我国广东地区2013年出现的A型Sea-97/G2,其来源是位于亚洲大陆的东南亚地区[22]，其他地区如欧洲国家和俄罗斯等地区也有见此病毒的报道。总体上说FMDV的暴发形式为在部分区域流行、范围宽广。对于我国来说，从2005年到2014年这十年间，已经向OIE报道FMDV的发生达到115次。其中群1中的C型FMDV最后一例在2005年于埃塞俄比亚发生，故我国目前不再存在C型口蹄疫。我国主要流行的FMDV为O型、A型和Asia 1型等3个血清型。在这10年间，O型FMD暴发38次、A型FMD暴发31次、Asia 1型FMD暴发46次，但Asia 1型均发生于2009年以前[23]。这些疫病的暴发多为境外外来毒株的传播，如2010年于我国广东省暴发的O型Mya-98和2013年的A型Sea-97/G2，其起源均为亚洲的东南亚地区。贵州地区于2011年出现的PanAsia毒株则来源于南亚地区。在2017年起源是印度大陆FMDV O/ME-SA/Ind2001系毒株，在我国新疆省首次被发现命名为O/XJ/CHA/2017[24]。此外南非型口蹄疫大多局限于非洲地区的撒哈拉沙漠以南区域。不同的血清型分布区域有所差异，其中SAT3血清型分布较其他2种南非型广泛。但是发病率最高的却为SAT2-FMDV。最近随着全球的经济贸易和进出口的发展。SAT2-FMDV已经从非洲地区扩散到巴基斯坦，由于中国西南部与巴基斯坦毗连存在着南非型口蹄疫从巴基斯坦传播到我国的风险。因此防控局势较为严峻[21]。

4 LAMP在口蹄疫诊断中的应用

因口蹄疫病毒的重要性，它的诊断方式在家畜疾病领域一直被作为重点研究的对象，随着口蹄疫的不断发展，其诊断方式也不断丰富起来。归结起来主要分为3大类：一类是血清学检测——根据抗原抗体以及补体之间的特殊结合作用来检测病原，包括病毒中和试验(Virus neutralization test，VNT)、补体结合试验(Complement Fixation Test,CFT)、琼脂扩散试验(Agar Gel Immunodiffusion,AGID)、酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)[25]。一类是病原分离——被OIE确定为病原确诊的“黄金标准”。主要通过细胞的培养和动物接种，观察接种之后细胞是否会出现相应的生长状态或者相应的细胞病变以及动物接种之后会出现同样的临床症状。最后一类是分子生物学检测——利用引物，对FMDV基因某些特定的片段等进行扩增，然后再进行进一步确认或者当场就可以确认结果，包括RT-qPCR、PCR和LAMP等检测方法。血清学检测中ELISA方法被研究得最多，我国已有Asia 1、O和A型固相竞争ELISA抗体检测方法；非结构蛋白抗体特异性单抗阻断ELISA，检测3ABC蛋白ELSIA以区分野毒感染和疫苗毒免疫等多种各异的ELISA检测方法[26]。病原分离方法主要应用于幼地鼠肾细胞系和猪肾细胞系，其检测灵敏度高但耗时较长。分子生物学检测的qPCR中设计特异性引物，制作成试剂盒，通过荧光实时定量PCR进行检测，可以有效、准确地区分A、O和Asia 1等多个血清型的口蹄疫病毒。LAMP检测技术也应用于了口蹄疫病毒的鉴定。2008年泰智锋[27]和2009年李健[28]等分别报道了口蹄疫病毒的RT-LAMP检测方法的建立。泰智锋等[27]针对口蹄疫病毒的O、A、C和Asia 1这4种血清型的3D区域设计了6条引物，陈沁则收集了232株不同血清型的口蹄疫病毒株核苷酸序列信息利用相关网站设计了LAMP的引物。泰智锋等[27]的LAMP检测结果是在反应结束后向体系中加入SYBR Green 1染料，在紫外灯照射下观察是否有绿色荧光的产生。李健等[28]则是对比了核酸凝胶电泳法、沉淀观察法和Picogreen绿色荧光法3种不同方法，最后证实Picogreen荧光检测法是这3种检测方法中最为简便、可靠的一种。随后范晴等[29-30]先后建立了口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒二重RT-LAMP鉴别检测方法和口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒二重荧光RT-LAMP方法鉴别检测方法，能同时鉴别口蹄疫病毒的A、O、Asia 1等亚型和水泡性口炎的新泽西型和印第安亚型。前者在内引物之间插入了EcoRⅠ酶切位点,反应之后通过酶切回收的基因片段测序，确定扩增的核酸片段为目的基因。后者在内引物5′加上标记的荧光基团，通过不同荧光通道显示不同的颜色。对比而言，后者更比前者具有成本少、时间短的优点。韩国的Lim等[31-32]分别开发并评估了基于引物的逆转录环介导的等温扩增(sRT-LAMP)检测血清型O型、A型FMDV的敏感和特异性。这2个实验特异性扩增了O型FMDV的VP3基因和A型FMDV的Sea-97基因型的VP1基因。检测的检测限都为102TCID50/mL，比RT-PCR灵敏10倍，与qRT-PCR的灵敏度相当。与其他病原没有阳性反应。此外分子检测和微流体技术的发展为快速检测动物病毒方面开辟了新的途径。Yuan等通过整合LAMP检测技术和微流控芯片技术——离心微流体盘(CMFD)，62 ℃、60 min内可成功检测包括口蹄疫病毒在内的多种病毒。其灵敏度与每个反应1×102个拷贝的管型LAMP浊度法相当。Yuan等研究发现CMFD在检测口蹄疫病毒等目标方面具有高度特异性，与猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒等没有交叉反应。利用CMFD对6种猪病毒临床样品进行检测，结果表明：CMFD比传统PCR检测混合病毒感染更敏感阳性检出率为44.0%。分子检测和微流控芯片技术的结合运用为检测病原体提供快速、可靠的检测方法，特别是多种混合感染临床样本中的病毒的检测[33]。