玉米萌发成苗期渗透调节机制的研究进展

陈 珊，毕鑫屹，刘美玲，李 楠，崔震海，张 敖，阮燕晔

(沈阳农业大学 生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866)

玉米是世界重要的食物来源之一，同时，也是中国重要的粮食、饲料和工业原料作物，其产量影响中国的粮食供应安全及经济稳定发展。种子萌发出苗是玉米生活周期的开始阶段，出苗率高、苗齐、苗壮是植株健康生长和高额籽粒产量形成的基础[1]。玉米种子萌发至3叶期属成苗阶段，是植株从依靠胚乳的异养生长向依靠叶片光合的自养生长的转变过程，该阶段的生长受环境水势、温度和氧气供应等因子影响。这些因子不仅影响胚乳贮存物质的分解及向胚的输送，还影响胚的生长、叶片及光合能力的形成。吸水是玉米种子启动萌发的第一步，对萌发至关重要[2-3]。虽然玉米对干旱的适应能力较强，适度水分限制有利于种子萌发和产量形成[4-6]，但严重的水分亏缺降低细胞膨压，从而抑制细胞的分裂、扩大和分化[7]进而影响种子萌发和幼苗生长[8]。干旱是我国玉米减产的主要因素[9]，其中春旱一直是北方玉米种植面临的严峻问题[10-11]。春旱引起播种延迟、播下的种子不萌发、萌发不良难以成苗，或成苗质量不高等问题，最终可使玉米减产20%～30%，甚至更多[12]。但是，不同玉米基因型萌发成苗阶段对干旱胁迫的敏感性存在显著差异[13-15]。采用适当的农艺措施可以提高萌发成苗期的抗旱性[16]。通过改良玉米品种萌发成苗期的抗旱性，或改进抗旱栽培措施，可以提高适时播种率和幼苗质量，进而提高产量。了解种子萌发成苗期抗旱性的生理和分子机制将有助于玉米抗旱育种和抗旱栽培措施的研究。而渗透调节是种子萌发成苗阶段适应干旱环境的关键机制之一[17]，本文介绍了该方面的研究进展，并对存在问题进行了讨论。

1 萌发成苗期的吸水过程和渗透调节

吸水是种子萌发的第一步，是干种子细胞恢复正常结构和生理功能及幼苗形态建成的基本条件。玉米种子吸水包括吸胀吸水和渗透吸水2个机制。在初始阶段，吸水以吸胀机制为主，由于干种子有非常低的衬质势，因此具有强大的吸水能力，在较低的环境水势下也能够吸收水分，而且吸水迅速[18]。然而，研究发现，在渗透胁迫下，不同品种之间萌动期的吸水率与发芽率不存在一致关系[19-20]，可能的原因是当吸水超过某一阈值之后，种子萌发不受含水量的影响。种子吸水后，胚细胞开始恢复正常的结构和生理功能。这个阶段的关键事件是构成生物膜的脂类物质从非双层排布转变为双分子层结构，使膜具有生理功能，细胞内可以积累溶质产生渗透势。随之，细胞衬质势在吸水中的作用降低，其吸水功能逐渐被渗透势所取代，细胞吸水转变为以渗透机制为主。但需要注意的是，当胚细胞开始以渗透机制吸水时，胚乳可能仍以吸胀机制吸水。但随着幼苗的生长，渗透吸水占萌发种子总吸水量的比例逐渐增大。

在渗透吸水阶段，细胞需要不断地降低渗透势或维持较低的渗透势以吸收水分。相对于吸胀机制，渗透吸水对环境水势降低更为敏感。受渗透胁迫幼苗的含水量与对照相比会剧烈降低[3]，因此，这个时期的干旱对玉米种子萌发和成苗容易产生较大的不利影响[21]。种子萌发成苗阶段是形态结构剧烈变化的阶段，需要旺盛的细胞分裂、扩大和分化，其基础是足够大的细胞膨压[7]。在干旱胁迫下，萌动的种子或幼苗的渗透势必须低于环境水势才能从外部吸收到水分。在这种逆境条件下，细胞主动增加胞内溶质或维持较高浓度的溶质来调节渗透势的生理机制称为渗透调节(Osmotic Adjustment,OA)。在渗透吸水阶段，种子萌发对干旱的适应能力主要决定于细胞的渗透调节能力。玉米种子在萌动期受到渗透胁迫，吸水率降低，萌动时间延长，而且不同品种的表现差异很大[20]，其主要原因可能是不同品种渗透调节能力存在差异。

在细胞内，降低渗透势的调节物质包括无机离子和有机小分子两大类；无机离子主要有钾、镁、钠离子等；有机渗调物质包括可溶性糖、可溶性蛋白、氨基酸及其衍生物，如脯氨酸、甘氨酸和甜菜碱等[22]。有机渗调物质不仅能够降低渗透势，还具有保护生物膜、分子伴侣、核酸保护、猝灭金属离子、清除活性氧等功能[23]。在受到渗透胁迫时，无机渗调物质主要分布在液泡中，有机渗调物质主要分布于细胞浆和除液泡外的细胞器中[24]。

2 钾离子的吸收和分布

无机离子是植物重要的渗透调节物质，在玉米种子萌动期细胞无机离子来自自身的贮存，当胚根突破种皮后，胚从外界吸收无机离子。钾是植物重要的无机渗透调节物质[25]。用0.1～10.0 mmol/L氯化钾浸泡后，玉米种子在正常条件下的发芽势、活力指数和幼苗干重提高[26]，如果钾浓度过高则抑制玉米种子萌发和幼苗生长[27]。但是在干旱条件下，用适量钾预处理玉米种子则可以增加幼苗相对含水量和有机渗调物质的含量[28]。随着生长，幼苗对外界钾离子的需求量增大，在干旱胁迫下，幼苗对钾的需求量会更大。此外，在干旱胁迫下，钾离子在萌发的种子或幼苗体内的分配和再分配将影响种子萌发和成苗能力。然而，关于钾离子在种子萌发过程的分布变化尚未见报道。研究发现，在低钾条件下，玉米体内存在钾的再分配。过表达细胞膜钾转运蛋白的调节蛋白基因ZmCIPK23的玉米植株，在低钾条件下，茎节的钾含量显著高于对照，而老叶和上部展开叶的钾含量显著低于对照[29]。目前尚不清楚在该过程中ZmCIPK23所调节的钾转运蛋白的相关机制。在拟南芥中，钾转运蛋白(KUP)对渗透胁迫产生响应，蛋白激酶SNF1相关蛋白激酶2E(SRK2E)是ABA信号传导的关键组分，与KUP6相互作用并磷酸化KUP6，这表明KUP的功能受ABA信号传导复合物调节[30]。

玉米根部对钾的吸收与细胞膜上钾转运蛋白的活性有关。目前，玉米根系吸收钾离子的转运蛋白鉴定及活性调节研究已经取得重要进展。ZMK1(拟南芥钾转运蛋白AKT1的同源基因)主要在玉米根部表达，其编码蛋白具有钾吸收功能[31]，钙感受器CBL1/9和蛋白激酶CIPK23复合体共同调节拟南芥的AKT1蛋白活性。研究发现，玉米的拟南芥CIPK23同源蛋白基因ZmCIPK23能够单独激活ZMK1的钾转运活性，而加入CBL1的同源蛋白基因ZmCBL1则进一步增强其活性。ZmCBL1定位于细胞膜上，而ZmCIPK23没有特异定位，两者都主要在根部表达[31]。玉米的ZmCIPK23还可能参与钾离子在体内的分配。如前所述，在低钾条件下，ZmCIPK23过表达促进钾离子玉米茎中的积累[29]。但是，在干旱胁迫下，玉米幼苗细胞膜钾转运蛋白基因的时空表达模式以及活性调控机制尚未见报道。

3 可溶性糖浓度的变化

在植物的生命周期中，种子萌发和早期幼苗生长的物质基础来自胚乳的贮存物质。淀粉是玉米种子的主要贮存物质。在种子萌发成苗过程中，胚乳中贮存的淀粉分解，其产物可溶性糖(如蔗糖、葡萄糖和果糖等)转运到胚的生长部位，供呼吸消耗，以及作为信号分子、代谢前体和渗调物质[32]。在干旱处理下，玉米叶片的可溶性糖含量增加，是细胞重要的渗调物质，随着胁迫时间的延长，其含量持续降低，如干旱胁迫增加了玉米幼苗叶片和根部可溶性糖的含量[33]。复水后，叶片中的可溶性糖含量较复水前有所降低。在干旱条件下，不同玉米基因型的淀粉分解和转运存在差异。干旱胁迫还降低胚乳贮存物质向胚和幼苗的转运数量，而且玉米干旱敏感基因型下降的比例大于非敏感型[34]。在渗透胁迫下，萌发率受影响较小的郑单958和辽单565有较高的贮存物质转运率，而萌发受影响较大的品种则有非常低的转运率[19,35]。胚乳贮存物质的转出率无疑将影响胚和幼苗中的可溶性糖浓度，进而影响渗透势。

种子胚乳中物质的运出率与淀粉酶的活性有关[20]，也与蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖转化酶的活性密切相关[32]。在干旱条件下，萌发种子的淀粉酶活性减低[20]。比较6个玉米杂交组合，在水分胁迫下仍然保持较高的发芽势和发芽率的组合，有较高的贮存物质转运率和较高的淀粉酶活性[20]。玉米胚乳中的糖向胚中的运输受质膜蔗糖转运蛋白(Sucrose Transporters,SUCs或SUTs)的调节。玉米苗期早期应答干旱的基因ZmERD6，属于MFS家族的蔗糖转运蛋白亚族，其表达受干旱胁迫和外源ABA处理的诱导[36]。属于蔗糖转运蛋白低亲和、高转运能力SUT4亚族的玉米ZmSUT4基因也已被克隆[37]，磷酸蔗糖合成酶也参与叶片中可溶性糖含量的调节[38]，但是这些基因在种子萌发期渗透调节中的调节和作用还有待研究。

4 可溶性蛋白、游离氨基酸、脯氨酸和甜菜碱

的积累

可溶性蛋白、游离氨基酸、脯氨酸和甜菜碱均属于氨基酸或氨基酸的衍生物质。它们是细胞的相容溶质。在短期严重干旱的情况下，它们不是植物的主要渗调物质，但随着干旱期的延长，它们对于植株抗旱性的贡献逐渐加大，不仅作为渗透调节物质，而且起保护和稳定其他蛋白和细胞膜、清除活性氧的作用[23]。

在玉米种子的萌发成苗阶段，干旱胁迫诱导可溶性蛋白和氨基酸类物质的积累。3叶期玉米幼苗停水处理12 d，叶片可溶性蛋白达13 mg/g[39]；在聚乙二醇(PEG)胁迫下，叶片可溶性蛋白与对照相比增加41.6%[40]。但是较长时间的干旱胁迫将导致可溶性蛋白含量下降。在干旱胁迫时积累的可溶性蛋白中，包括胚胎发育后期丰富蛋白(Late Embrygenesis Abundant Protein,LEA)[41]。LEA蛋白是一大类耐热可溶性、亲水性小分子蛋白质，具有渗透调节、保护生物膜、猝灭金属离子、清除活性氧等功能，它们基本上位于细胞质和细胞核区域。根据氨基酸序列和相应的mRNA同源性，可将LEA蛋白分为6组(家族)，其中第一组的Emb564[41]、第二组的Rab17[42]、第三组的Mlg3[42]和ZmLEA3[43]、第四组的LEA 4[44]、第五组的ZmLEA5C[45]蛋白都在干旱胁迫下的玉米中表达。在渗透胁迫下，玉米幼苗根系中还产生63.5 kDa的热稳定蛋白[46]，其具体类别和功能还有待研究。

在干旱胁迫下，正在萌发的种子中的游离氨基酸含量增大[47]。随着干旱胁迫程度的加重和时间的延长，玉米幼苗根系的脯氨酸含量呈现出先升后下降的趋势[48]。3叶期玉米幼苗干旱处理12 d，叶片脯氨酸含量可达414 μg/g，比停水前增加约4倍[39]。在PEG胁迫下，3叶期玉米幼苗叶片脯氨酸含量增加51.63%，含量约达1.9 μg/g[40]。有研究表明，渗透胁迫下脯氨酸的产生与积累有ABA依赖型和非ABA依赖型2种途径[49]。在干旱胁迫下，抗旱性强的玉米叶片中甜菜碱含量随着干旱胁迫的加强，其增加的幅度较大，而抗旱性弱的品种增加幅度较小[50]，而且，外源喷施0.5 mmol/L的甜菜碱溶液能缓解玉米幼苗的干旱伤害，增大叶片相对含水量[51]。

目前已经从玉米中鉴定到细胞膜中转运氨基酸和寡肽的转运蛋白，如氨基酸/生长素通透酶(AAAP)[52]、ZmPOT[53]、寡肽转运蛋白基因(ZmOPT0212)[54]。不过，这些转运蛋白在干旱胁迫下的表达情况及与游离氨基酸积累的关系尚未见报道。

5 渗透调节的ABA调节

ABA是影响植物渗透调节能力的重要激素，外施ABA可以提高玉米叶片的水势，增大脯氨酸和甜菜碱含量[55]；在渗透胁迫下,外施ABA可显著提高脯氨酸含量，对可溶性糖含量有一定的影响，对游离氨基酸总量[56]和K+的影响不大[57]。

外源ABA诱导玉米V-ATPase亚基A(ZmVHA-A)和亚基B(ZmVHA-B)基因的表达[58]，而V-ATPase促进溶质的跨膜转运。磷脂酶D/C(PLD/PLC)、Ca2+/CAM可能参与了外源ABA促进脯氨酸积累的信号传递。其中，磷脂酶D(PLD)也可水解磷脂产生磷脂酸(PA)，后者通过影响蛋白激酶和蛋白磷酸化酶等调控ABA信号转导途径[59]。ABA还促进受渗透胁迫和水杨酸(SA)诱导的玉米幼苗根系中的63.5 kDa热稳定蛋白基因的表达[46]。

ABA的合成、分解和信号通路影响植物的渗透调节能力。玉米的ZmNCED1是ABA生物合成过程中的关键基因，而ZmCYP707A2是ABA分解代谢的重要基因[60]。在玉米种子低温萌发过程中，外源水杨酸和H2O2的协同处理下调ZmNCED1基因的表达，上调ZmCYP707A2的表达[60]，前者和ZmAO2(拟南芥AAO3的同源物)在渗透胁迫下玉米幼苗的冠根和种子根中显著上调[61]，促进ABA的生物合成。

ABA可直接调节的PYR1/PYL/RCARs相关基因也是渗透调节能力形成的关键因子。研究表明，玉米含有13个PYL家族成员(ZmPYL1-13)，利用368个玉米自交系的关联分析确定ZmPYL8和ZmPYL12与抗旱性具有显著相关性[62]。ABA的信使蛋白编码基因ZmSnRK2.1和ZmCPK11分别编码蔗糖非发酵相关蛋白激酶和钙依赖性蛋白激酶，在渗透胁迫下被上调表达[63]。SNF1相关蛋白激酶2(SnRK2)是ABA信号通路的关键调节者[64]，另有研究表明，在玉米幼苗期，14个SnRK2s中的ZmSnRK2.7和ZmSnRK2.11在由高盐引起的渗透胁迫下相对上调[61]。一些转录因子，包括MYB/MYC、NAC、WRKY和锌指蛋白也被鉴定为植物渗透胁迫响应因子，这些转录因子已被证实在盐胁迫下上调表达[61]。在干旱胁迫下，这类转录因子参与ABA的信号转导途径[65-67]。

6 渗透调节的相关基因

在干旱胁迫下，玉米蛋白激酶基因ZmPtil、ZmPtil-1、ZmCIPK2的表达上调，转ZmPtil基因的玉米植株相对含水量、可溶性糖和脯氨酸含量分别比对照高7.3%、2.5%和22.7%[68]。腺苷甲硫氨酸合成酶基因ZmSAMS1在玉米幼苗的根、茎、叶中的表达，在干旱和高温胁迫下表达量有较大幅度的上调[69]，从而合成较多的多胺和亚精胺，参与环境胁迫的防御[70]。植物中广泛存在的一种C2H2型锌指蛋白参与植物的胁迫应答反应和生长发育调控过程，玉米中的该类转录因子ZmC2H2-1基因表达受干旱和ABA等抑制，过表达该基因的拟南芥叶片失水速率更快，可能是玉米渗透调节的负调控基因[71]，其在种子萌发过程中的表达行为尚不清楚。

同源异型-亮氨酸拉链(HD-Zip)转录因子和C2H2在植物中的功能相似，调节植物的发育过程和胁迫响应[72]。玉米中HD-Zip家族的大部分基因序列与拟南芥和水稻的具有很大的相似性。Mao等对玉米中HD-Zip蛋白基因进行表达分析，结果表明：55个该基因随机分布在10条染色体上，具有15个节段重复和4个串联重复事件，这表明节段重复是玉米HD-Zip家族结构差异的主要贡献者。而且，这4个类别的蛋白基因在不同组织和干旱条件下表达水平和模式存在差异[73]。对玉米、水稻、拟南芥、葡萄和葡萄球菌的HD-Zip蛋白系统发育分析表明，可以分为四类(Ⅰ～Ⅳ)，其中Ⅰ类和Ⅲ类蛋白的拷贝数相对保守[73]。其中，HD-Zip Ⅰ在玉米中有17个，绝大部分的启动子区域均含有一至多个抗逆相关顺式作用元件，12个HD-Zip Ⅰ在干旱胁迫下表达显著上调，其余5个表达下调。从中鉴定到的Zmhdz10基因表达受盐胁迫和ABA诱导，在渗透胁迫下该转基因水稻有较高的脯氨酸含量[74]。然而，这类基因在玉米种子萌发过程中的表现尚未见研究。

7 问题与展望

渗透调节是玉米种子在干旱胁迫下萌发成苗的关键生理过程。研究表明，玉米幼苗不同部位对干旱胁迫的敏感性不同，叶片最容易受到干旱胁迫的影响，根系次之，中胚轴再次之，茎最不敏感[75]，但是，对于这些部位渗透调节能力的差异研究还不够深入。研究表明：不同玉米基因型的渗透调节能力存在显著差异，但是过去我们更多地关注了是具体渗调物质含量的差异，而不是产生这种差异的原因。在玉米萌动种子和幼苗中，参与渗透调节的物质有无机离子、可溶性糖、可溶性蛋白、游离氨基酸、脯氨酸和甜菜碱等。其中对于无机离子的研究还比较薄弱，我们还需要更多地了解萌动期无机离子的转运和再分配的机制，以及与有机渗调物质的平衡。对于有机渗透调节物质，在种子萌发成苗阶段，它们都主要来自胚乳贮存的物质，因此其含量受这些有机物质之间相互竞争和转化的影响。不同类别渗调物质之间的比例对抗旱性的影响，这种比例变化与干旱胁迫程度和进展，以及与萌发成苗的阶段、不同部位的关系，受何种机制的调节也值得研究。对于某一类渗调物质，其合成、降解、运输都影响其在局部的含量，这些过程涉及到的酶和转运蛋白编码基因，尽管已经有一些了解，但是还缺乏系统性的认识。