里氏木霉液体深层发酵纤维素酶及其酶促打浆工艺

权利要求书

1. 一种纤维素酶的制备方法， 其特征在于：所述纤维素酶使用的生产菌株为里氏木霉（Trichoderma reesei），其保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期2008年11月25日，保藏号为CGMCC No.2785。

所述纤维素酶的制备方法如下：将里氏木霉试管斜面菌种接入液体种子发酵罐（1）中进行种子发酵得到所需要的液体种子，然后按照一定的接种量将液体种子接入纤维素酶发酵罐（2），并且在一定的发酵工艺条件下发酵，最后经过离心分离制得所需纤维素酶酶液，并将其储存在纤维素酶存储罐（3）中以备用。 所述发酵工艺参数如下：

（1）里氏木霉试管斜面培养基：1%～2%CMC，4%～8%营养元素液，0.1%～0.5%微量元素液，2%～3%琼脂，pH=6.0；

（2）里氏木霉菌种的培养：将菌种接于斜面培养基上，在培养箱中于（29±1） ℃条件下培养4～7 d 后使用或4 ℃下保存备用；

（3）液体种子发酵培养基：1%～3%葡萄糖，4%～8%营养元素液，1%～4%麸皮，0.1%～0.4%微量元素液；

（4）纤维素酶发酵培养基：碳源为0.1%～3%速生材硫酸盐浆，8%～10%营养元素液，0.2%～0.5%微量元素液，1%～4%麸皮，0.1%～0.2%表面活性剂Tween-80；

（5）液体种子发酵条件：温度30～40 ℃，pH=5～7，搅拌速度250～300 r/min，通风量0.2～0.3 m3/h，发酵时间36～48 h；

（6）纤维素酶发酵条件：温度30～40 ℃，pH=5～8，接种量2%～3%，搅拌速度250～300 r/min，通风量0.2～0.3 m3/h，发酵时间72～96 h。

所述营养元素液其配方为：3～10 g 柠檬酸钠，5～20 g 磷酸二氢钾，1～10 g 硫酸铵，0.5～5 g 硫酸镁，0.1～5 g 氯化钙，溶解后定容至100 mL。

所述微量元素液配方为：1～5 g 硫酸亚铁，0.1～1 g硫酸锰，0.1～1 g 氯化锌，0.5～5 g 氯化钴，1～10 mL 2 mol/L 的HCl，溶解后定容到100 mL；上述所有百分比均以质量计。

2. 权利要求1 所述的方法，其特征在于：所述碳源为思茅松硫酸盐浆。

3. 权利要求 所述的方法，其特征在于：酶液的制备过程中，种子发酵培养基采用1%葡萄糖、4%营养元素液、1%麸皮、0.1%微量元素液，在温度30 ℃、pH=6、搅拌速度250 r/min、通风量0.2 m3/h 的条件下发酵48 h，得到所需要的液体种子；然后按照2%的接种量，将种子接入纤维素酶发酵罐（2），发酵培养基采用碳源为0.1%的速生材硫酸盐浆、8%营养元素液、0.2%微量元素液、1%麸皮、0.2%表面活性剂Tween-80，在温度30 ℃、pH=6、接种量2%、搅拌速度300 r/min、通风量0.3 m3/h 的条件下发酵96 h。

4. 一种采用权利要求1 所述方法制得的纤维素酶用于酶促打浆的方法，其特征在于：纸浆为速生材硫酸盐浆， 按照权利要求1 所述的方法制备纤维素酶并将其储存在纤维素酶存储罐中以备用， 将纤维素酶存储罐（3）中的酶液通过计量泵以7 u/g 的酶用量以FPA 酶活为单位，输送到纸浆反应池（4）对纸浆进行预处理，处理条件为浆浓10%、温度50 ℃、pH=7.8、处理时间1 h，经纤维素酶处理后的纸浆输送到盘磨机(5)进行打浆。

技术领域

本发明涉及一种纤维素酶酶促打浆工艺， 尤其涉及一种里氏木霉液体深层发酵纤维素酶及其酶促打浆工艺。

背景技术

打浆是制浆造纸过程的重要环节， 对纸幅的物理性能产生效应。然而，打浆是一耗能工段。为了得到所需要的纸浆性质， 打浆或磨浆将消耗大量的能源，大约占从原料到成纸所需总能源的18%。 因此，任何能够显著降低打浆或磨浆能耗的纸浆处理方法将对整个能量输入产生有益影响。

Pratima Bajpai 发表在《TAPPI Journa1》2006年第5 卷11 期第25—32 页“Use of enzymes for reduction in refining energy-laboratory studies”一文的研究表明：印度Biocon 公司的Biorefine L 纤维素酶和美国Dyadic 国际公司的FiberZyme LBR 纤维素酶能够有利地降低打浆能耗， 并且纸浆的强度性能没有受到影响。

鞠成民发表在《中国造纸》2006年第25 卷1 期第71—72 页 “生物酶对未漂针叶木打浆性能的影响” 一文中介绍了N613、N476、N342、HC、D401 和D501 等诺维信商品纤维素酶和半纤维素酶在提高打浆性能和改善纸浆强度方面的影响。

上述研究所用的纤维素酶都为商品酶， 并非根据实际情况而自制纤维素酶用于酶促打浆。 由于现在商品纤维素酶价格比较高， 使得工厂使用起来成本很高；此外，国内的造纸原料短缺，大部分速生木材如马尾松、 落叶松和思茅松等针叶木的纤维又粗又长，其硫酸盐浆很难打浆，使得商品浆的市场竞争力弱，经济效益差。 为此，纸业界亟待开发根据生产厂的具体情况， 采用就地自制的纤维素酶酶液进行酶促打浆工艺， 以达到降低生产成本和打浆能耗的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种里氏木霉液体深层发酵纤维素酶及其酶促打浆工艺， 使用里氏木霉液体深层发酵纤维素酶对速生材硫酸盐浆进行酶促打浆，可降低打浆能耗和生产成本。

本发明为实现上述目的，采用的技术方案如下：

一种纤维素酶， 其特征在于所使用的生产菌株为里氏木霉（Trichoderma reesei），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期2008年11月25日，保藏号为CGMCCNo.2785。 里氏木霉为好氧菌，生长环境粗放，适应性较强，易于控制，便于管理，其代谢物安全无毒，不会影响生产人员和环境，所产纤维素酶的稳定性好，不宜退化。

纤维素酶的制备方法如下： 将里氏木霉试管斜面菌种接入液体种子发酵罐中进行种子发酵得到所需要的液体种子； 然后按照一定的接种量将液体种子接入纤维素酶发酵罐， 并且在一定的发酵条件下发酵，最后经过离心分离制得所需纤维素酶酶液，并将其储存在纤维素酶存储罐中以备用。

发酵工艺参数如下：

（1）里氏木霉试管斜面培养基：1%～2% CMC，4%～8%营养元素液，0.1%～0.5%微量元素液，2%～3%琼脂，pH=6.0；

（2）里氏木霉菌种的培养：将菌种接于斜面培养基上，在培养箱中于（29±1） ℃条件下培养4～7 d 后使用或4 ℃下保存备用；

（3） 液体种子发酵培养基：1%～3%葡萄糖，4%～8%营养元素液，1%～4%麸皮，0.1%～0.4%微量元素液；

（4）纤维素酶发酵培养基：碳源为0.1%～3%速生材硫酸盐浆，8%～10%营养元素液，0.2%～0.5%微量元素液，1%～4%麸皮，0.1%～0.2%表面活性剂Tween-80 ；

（5）液体种子发酵条件：温度30～40 ℃，pH=5～7，搅拌速度250～300 r/min，通风量0.2～0.3 m3/h，发酵时间36～48 h；

（6）纤维素酶发酵条件：温度30～40 ℃，pH=5～8，接种量2%～3%，搅拌速度250～300 r/min，通风量0.2～0.3 m3/h，发酵时间72～96 h；

所述营养元素液的配方为：取3～10 g 柠檬酸钠，5～20 g 磷酸二氢钾，1～10 g 硫酸铵，0.5～5 g 硫酸镁，0.1～5 g 氯化钙，溶解后定容至100 mL；

所述微量元素液配方为：1～5 g 硫酸亚铁，0.1～1 g硫酸锰，0.1～1 g 氯化锌，0.5～5 g 氯化钴，1～10 mL 2 mol/L 的HCl，溶解后定溶到100 mL；上述所有百分比均以质量计。

在本发明的纤维素酶的制备方法中， 所用的发酵碳源为思茅松硫酸盐浆。

在本发明的纤维素酶的制备方法中，其酶液的制备过程中， 种子发酵培养基采用：1%葡萄糖，4%营养元素液，1%麸皮，0.1%微量元素液，在温度30 ℃，pH=6，搅拌速度250 r/min，通风量0.2 m3/h 的条件下发酵48 h， 得到所需要的液体种子； 然后按照2%的接种量，将种子接入纤维素酶发酵罐，发酵培养基采用：碳源为0.1%的速生材硫酸盐浆，8%营养元素液，0.2%微量元素液，1%麸皮，0.2%表面活性剂Tween-80， 在温度30℃，pH=6；接种量2%，搅拌速度300 r/min；通风量0.3m3/h 的条件下发酵96 h。

用本发明的纤维素酶的制备方法所制得的纤维素酶产品的性能：纤维素酶酶液的酶活分别为FPA 酶活为900～1500 u/mL，Cx 酶活为3000～4000 u/mL，Cb酶活为10～100 u/mL，Cl 酶活为500～1000 u/mL。

采用本发明制得的纤维素酶用于酶促打浆，其打浆工艺为：纸浆为速生材硫酸盐浆，按照本发明所述的方法制备纤维素酶并将其储存在纤维素酶存储罐中以备用， 将纤维素酶存储罐中的酶液通过计量泵以3～9 u/g 的酶用量（以FPA 酶活为单位），输送到纸浆反应池对纸浆进行预处理。

处理条件为：浆浓3%～10%、温度40～60 ℃、pH=6～8、处理时间1～2 h，经纤维素酶处理后的纸浆输送到盘磨机进行打浆。

在本发明的打浆工艺中，所述速生材硫酸盐浆为思茅松硫酸盐浆，酶用量7 u/g（以FPA 酶活为单位），将浓10%，温度50 ℃，pH=7.8（纸浆本身pH），处理时间1 h。

本发明的有益效果是：1. 工艺简单， 生产成本低；2. 采用所要处理的纸浆为发酵碳源能够显著提高酶液的适应性；3. 纤维素酶的酶活高、用量少、针对性强、效果好；4. 降低打浆能耗，对纤维本身的损伤小。

具体实施方式

图1 是本发明纤维素酶酶促打浆工艺流程示意图。 以下结合附图和实施例对本发明详细说明。

图1 纤维素酶酶促打浆工艺流程示意图

实施例1

参见图1，一种纤维素酶的制备，其使用的生产菌株为里氏木霉。 将里氏木霉试管斜面菌种接入液体种子发酵罐1 中进行种子发酵得到所需要的液体种子； 然后按照一定的接种量将液体种子接入纤维素酶发酵罐2，并且在一定的发酵条件下发酵，最后经过离心分离制得所需纤维素酶酶液， 并将其储存在纤维素酶存储罐3 中以备用。

酶液的具体制备： 将里氏木霉试管斜面菌种接入液体种子发酵罐1 中， 种子发酵培养基采用1%葡萄糖、4%营养元素液、1%麸皮和0.1%微量元素液，在温度30 ℃、pH=5.76、搅拌速度250 r/min、通风量0.2 m3/h 的条件下发酵48 h 得到所需要的液体种子； 然后按照2%的接种量将种子接入纤维素酶发酵罐2； 发酵培养基采用0.1%思茅松硫酸盐浆、8%营养元素液、0.2%微量元素液、1%麸皮和加入量为0.2%的表面活性剂Tween-80，在温度30 ℃、pH=6、搅拌速度300 r/min、通风量0.2 m3/h 的条件下发酵96 h， 然后经过离心分离制得所需纤维素酶酶液，并将其储存在纤维素酶存储罐3 中以备用。 所制纤维素酶酶液的酶活分别为：FPA 酶活981.67 u/mL，Cx 酶活3083.19 u/mL，Cb 酶活为27.79 u/mL，Cl 酶活571.42 u/mL。

酶促打浆工艺：纸浆为思茅松硫酸盐浆，将纤维素酶存储罐3 中的酶液通过计量泵以7 u/g 的酶用量(以FPA 酶活为单位)输送到纸浆反应池4，对纸浆进行预处理，处理条件为浆浓10%、温度50 ℃、pH=7.8(纸浆本身pH 值)、处理时间1 h，经纤维酶处理以后的纸浆输送到盘磨机5 进行打浆。

实施例2

比照浆样分别采用空白浆样和商品纤维素酶酶促打浆浆样。 按本技术领域技术人员公知的方法制备空白浆样， 即不使用本发明的纤维素酶对纸浆进行打浆。 在相同处理条件下， 采用商品纤维素酶进行酶促打浆。

按照国家纸浆物理性能检测方法， 测定本发明打浆浆样、 空白浆样和商品纤维素酶打浆浆样的物理性能，结果见表1。

表1 不同浆样的物理性能

从表1 中可以看出， 本发明的酶处理浆样能够明显降低磨浆机负荷， 从而节省磨浆能耗， 节能约25%，与商品纤维酶打浆的节能值相当，并且纸浆的物理性能没有受到太大影响。

采用里氏木霉发酵纤维素酶进行速生材硫酸盐浆酶促打浆，其工艺简单、设备投资少、成本低、工艺流程紧凑，具有降低打浆能耗的效果，适合应用于我国现有造纸原料结构状况下的制浆原料的打浆工艺。